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    高效表達淀粉酶Bacillus koreensis的培養(yǎng)基響應(yīng)面優(yōu)化

    2019-09-05 08:31:20李菁菁包可翔顏奕華姜振錕陳善義李易非
    關(guān)鍵詞:產(chǎn)酶淀粉酶煙葉

    何 偉,李菁菁,包可翔,顏奕華,姜振錕,林 儉,陳善義,李易非

    福建中煙工業(yè)有限責任公司技術(shù)中心,廈門 361021

    淀粉是煙草中一類重要的碳水化合物,新鮮煙葉通過調(diào)制,大部分淀粉經(jīng)酶解反應(yīng)降解為還原糖。但調(diào)制后的煙葉仍殘留少量淀粉,這對煙葉內(nèi)在質(zhì)量有不利的影響[1]。以淀粉形式存在的糖類在卷煙燃吸時會影響燃燒速率和完全性,并產(chǎn)生糊焦氣味,影響煙葉的香味和內(nèi)在品質(zhì),因此淀粉含量的高低對烤煙煙葉的品質(zhì)有重要影響[2,3]。現(xiàn)有調(diào)制方法中淀粉降解轉(zhuǎn)化不夠充分,導致中國成品煙葉的淀粉含量普遍偏高,約為4%~6%,遠高于國外優(yōu)質(zhì)成品煙中的淀粉含量(約為 1%~2%)[4,5]??竞鬅熑~淀粉殘留量過高已成為制約中國煙葉質(zhì)量提高的重要因素之一。

    近年來,利用外加微生物或酶制劑降低煙葉中的淀粉含量、提高煙葉的可用性己成為煙葉原料研究的熱點之一。馮穎杰等[6]研究發(fā)現(xiàn),向煙葉中施加高效產(chǎn)淀粉酶的蘇云金芽孢桿菌,煙葉中淀粉大幅度降低,煙葉的總糖、還原糖含量上升,有效提升了煙葉的整體質(zhì)量。沙云菲等[7]研究了淀粉酶復合酶制劑對上部煙葉的降解效果,處理后效果顯著。李曉等[8]采用α-淀粉酶、糖化酶分別處理烤煙和白肋煙,處理后煙葉品質(zhì)明顯改善。此外,這些生物技術(shù)在煙草中的應(yīng)用還必須考慮到微生物和酶制劑自身所帶來的污染、安全性和失活不穩(wěn)定等多種因素。

    本實驗室前期從云南馬龍C3F-2014煙葉表面篩選出一株能夠高效表達淀粉酶的Bacilluskoreensis。本研究以該菌株為研究對象,利用響應(yīng)面法優(yōu)化了其發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源、氮源和金屬離子,提高了Bacilluskoreensis表達淀粉酶的產(chǎn)量,為煙草天然源淀粉酶處理煙葉,提高煙葉品質(zhì)的工業(yè)化應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 菌種與培養(yǎng)基

    1.1.1Bacilluskoreensis,由云南馬龍C3F-2014片煙分離純化得到。

    1.1.2 種子培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基):10 g/L胰蛋白胨、5 g/L 酵母提取物、10 g/L 氯化鈉,pH=7.0。

    1.1.3 初始發(fā)酵培養(yǎng)基(牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基):3 g/L牛肉膏,10 g/L蛋白胨,5 g/L氯化鈉,pH=7.0。

    1.2 試劑與儀器

    試劑:胰蛋白胨等生物試劑,葡萄糖、淀粉、氯化鈉等分析純試劑,DNS等化學純試劑均購自于國藥集團化學試劑有限公司;牛肉浸膏購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;酵母粉購自英國Oxoid公司。

    主要儀器設(shè)備:SW-CJ-2FD型超凈工作臺,蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;CLC-B2V-M/CLC 222-TV型恒溫培養(yǎng)箱,MMM Group(德國);1-14型離心機,SIGMA(德國);DMG-9423A型烘箱,上海精宏;QS-2A型切絲機,鄭州嘉徳機電科技有限公司;Lambda 35型分光光度計,PerkinElmer(美國);VX-95型滅菌鍋,Systec(德國);Milli-Q Integral 5型純水機,Millipore(美國)。

    1.3 實驗方法

    1.3.1 菌種培養(yǎng)

    1.3.1.1 平板活化

    從甘油管中將菌種接種到牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上,37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h。

    1.3.1.2 種子培養(yǎng)基培養(yǎng)

    從平板上挑取單菌落接種種子培養(yǎng)基,發(fā)酵培養(yǎng)6 h至培養(yǎng)基渾濁,溫度為37 ℃,搖床轉(zhuǎn)速為180 rpm。

    1.3.1.3 發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)

    按3%的接種量將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基,發(fā)酵培養(yǎng)36 h,測定淀粉酶活。

    1.3.2 淀粉酶活的測定

    1.3.2.1 葡萄糖標準曲線的繪制

    按表1配制不同濃度的葡萄糖溶液反應(yīng)體系,沸水浴反應(yīng)5 min,冷卻后加蒸餾水定容到25 ml。0號為空白,作為調(diào)零管。用可見光分光光度計在540 nm波長處測定吸光光度值。

    表1 葡萄糖標準曲線配置表

    1.3.2.2 粗酶液淀粉酶活的測定

    將1 mL發(fā)酵液和1 mL 1%淀粉溶液混合并在 37 ℃水浴條件下保溫5 min(混合之前各自在37 ℃預(yù)熱5 min)。加入1.5 mL DNS試劑后在沸水浴5 min使酶失活,冷卻后用蒸餾水定容到25 mL??瞻诪榘l(fā)酵液和淀粉溶液混合直接沸水浴,再加1.5 mL DNS,沸水浴5 min,冷卻后用蒸餾水定容到25 mL。用可見光分光光度計在540 nm波長處測定樣品吸光光度值。

    1.3.2.3 淀粉酶活性定義及計算方法

    淀粉酶活力單位定義(U/mL):在37 ℃條件下,1 mL酶液每分鐘水解淀粉產(chǎn)生1 μg葡萄糖所用的酶量為1個酶活力單位。

    淀粉酶酶活力根據(jù)以下公式進行計算:

    淀粉酶酶活力(U/mL)=生成的葡萄糖毫克數(shù)×N×1 000/5

    式中:N-稀釋倍數(shù);1 000-轉(zhuǎn)化成 μg;5-反應(yīng)時間 5 min。

    1.3.3 單因素試驗

    分別對碳源、氮源、金屬離子、氯化鈉濃度、接種量、培養(yǎng)溫度、初始pH進行優(yōu)化,測定每種因素對淀粉酶活的影響,選擇最佳培養(yǎng)基成分。

    1.3.4 PB設(shè)計

    PB設(shè)計用于考察8個獨立變量對響應(yīng)值也就是淀粉酶活的影響,從而挑選出影響顯著的因素。每個獨立變量有個兩個水平,分別表示為+1和-1,各因素的設(shè)計濃度見表2。

    表2 PB設(shè)計培養(yǎng)基組分和水平

    1.3.5 BBD響應(yīng)面設(shè)計

    Box-Behnken設(shè)計適用于2~5個因素的優(yōu)化試驗?;赑B試驗設(shè)計和最陡爬坡試驗的試驗結(jié)果,采用3因素的Box-Behnken design(BBD)設(shè)計來分析各因素之間的關(guān)系并得到最優(yōu)培養(yǎng)基配方。以PB設(shè)計篩選得到的對淀粉酶活影響顯著的因素作為設(shè)計因素,以最陡爬坡試驗得出的濃度作為中心點,每個因素設(shè)有-1.68、-1、0、+1、+1.68五個水平(見表3)。

    表3 BBD設(shè)計的因素水平

    2 結(jié)果與分析

    以牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基作為初始發(fā)酵培養(yǎng)基對Bacilluskoreensis的發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化,初始發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵所得到的淀粉酶活為565.13 U/mL。

    2.1 單因素試驗

    2.1.1 碳源對Bacilluskoreensis表達淀粉酶的影響

    碳源是構(gòu)成菌體的基本骨架,是菌體生長的能量來源,通過影響菌體的呼吸、能量供給、生長及相關(guān)代謝最終影響抗生素等次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量[9]。選擇15 g/L的不同碳源進行碳源優(yōu)化試驗,結(jié)果如圖1所示,以淀粉作為碳源時酶活最高,其次是蔗糖和葡萄糖。因此,在下個階段的PB設(shè)計中,將淀粉作為考察因素。

    2.1.2 氮源對Bacilluskoreensis表達淀粉酶的影響

    氮源在合成菌體各種初級、次級代謝產(chǎn)物等含氮物質(zhì)的過程中發(fā)揮著重要作用,同時在發(fā)酵生產(chǎn)中氮源起著調(diào)節(jié)菌體的生長及生物量的作用[10]。選擇20 g/L的不同氮源進行氮源優(yōu)化試驗,結(jié)果如圖2所示,菌株以蛋白胨作為氮源時酶活較高,其次是酵母粉培養(yǎng)基。因此,在下個階段的PB設(shè)計中,將蛋白胨和酵母粉含量作為考察因素。

    圖1 不同碳源對淀粉酶活的影響Fig.1 The effect of different carbon sources on amylase activity注:1.淀粉,2.葡萄糖,3.乳糖,4.蔗糖,5.麥芽糖,6.對照(CK)。Note:1.Starch,2.Glucose,3.Lactose,4.Sucrose,5.Maltose,6.Contrast(CK).

    圖2 不同氮源對淀粉酶活的影響Fig.2 The effect of different nitrogen sources on amylase activity注:1.蛋白胨,2.酵母粉,3.胰蛋白胨,4.牛肉膏,5.牛肉膏+蛋白胨,6.牛肉膏+胰蛋白胨。Note:1.Peptone,2.Yeast extract,3.Tryptone,4.Beef extract,5.Beef extract+Peptone,6.Beef extract+Tryptone.

    2.1.3 金屬離子對Bacilluskoreensis表達淀粉酶的影響

    金屬離子是微生物生命活動中必不可少的一類營養(yǎng)物質(zhì),它們在機體中的生理功能主要是作為酶的活性中心的組成部分、維持細胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性等。不同金屬離子產(chǎn)酶發(fā)酵結(jié)果見圖3,培養(yǎng)基中添加Ca2+、Fe2+對菌株產(chǎn)酶有促進作用,而添加Mg2+和Zn2+對菌株產(chǎn)酶有一定的抑制作用,尤其是Zn2+對Bacilluskoreensis產(chǎn)酶有顯著的抑制作用。Ca2+和Fe2+的濃度試驗表明,添加濃度為0.5 g/L的Ca2+和Fe2+時,菌株酶活最高。因此,在下個階段的PB設(shè)計中,將CaCl2和 FeSO4·7H2O作為考察因素。

    2.1.4 不同鹽濃度對Bacilluskoreensis表達淀粉酶的影響

    不同鹽濃度產(chǎn)酶發(fā)酵結(jié)果見圖4,隨著培養(yǎng)基鹽濃度的增加,菌株產(chǎn)酶活力逐漸下降。當不添加鹽時,酶活最高,鹽濃度高于0.8%時,淀粉酶活顯著下降。因此,Bacilluskoreensis培養(yǎng)基選擇不添加 NaCl。

    圖3 不同金屬離子對淀粉酶活的影響Fig.3 The effect of different metal ion on amylase activity

    圖4 不同NaCl濃度對淀粉酶活的影響Fig.4 The effect of different concentrations of NaCl on amylase activity

    2.1.5 不同接種量對Bacilluskoreensis表達淀粉酶的影響

    由圖5可知,接種量對Bacilluskoreensis產(chǎn)酶影響較大。3%的接種量較之2%的接種量,酶活明顯提升,而5%和3%的接種量酶活基本持平,因此,選取3%的接種量為最佳接種量。

    圖5 不同接種量對淀粉酶活的影響Fig.5 The effect of different inoculum size on amylase activity

    2.1.6 不同初始pH對Bacilluskoreensis表達淀粉酶的影響

    pH 值是衡量培養(yǎng)基酸堿度的一個重要指標,發(fā)酵過程中主要影響微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用以及代謝產(chǎn)物的分泌,從而影響酶活力,每一種微生物都有其生長發(fā)酵的適宜 pH 范圍。由圖6可知,pH 值從5.0到8.0酶活隨 pH 的增加而增加。pH 為 8.0 時,酶活達到最大值,繼續(xù)增加 pH 值,酶活迅速降低。從總的變化趨勢來看,中性偏堿性環(huán)境有利于菌株產(chǎn)酶。因此,確定8.0為菌株產(chǎn)酶最佳初始 pH 值。

    圖6 不同初始pH對淀粉酶活的影響Fig.6 The effect of different initial pH on amylase activity

    2.1.7 不同培養(yǎng)溫度對Bacilluskoreensis表達淀粉酶的影響

    不同溫度產(chǎn)酶發(fā)酵結(jié)果表明,溫度對產(chǎn)酶影響很大,溫度過低,微生物代謝緩慢,隨著溫度升高,代謝加快,由圖7可以看出37 ℃時酶活最高,之后隨著溫度的升高,酶活反而降低。因此,確定 37 ℃為產(chǎn)酶最適培養(yǎng)溫度。

    圖7 不同溫度對淀粉酶活的影響Fig.7 The effect of different temperature on amylase activity

    2.2 Plackett-Burman設(shè)計

    通過單因素試驗表明,在Bacilluskoreensis產(chǎn)酶過程中,對其影響較大的8個變量為淀粉含量、蛋白胨含量、酵母粉含量、CaCl2含量、FeSO4·7H2O含量、NaCl含量、接種量和初始pH,再加上3個虛擬變量,每個變量有高(+)、低(-)2個水平[11],采用Design-Expert軟件設(shè)計試驗,共12組試驗(表4)。使用Design-Expert軟件對表4進行分析,得到 PB設(shè)計方差分析結(jié)果。由表5可知,該模型的P值 =0.009 4,表明該模型顯著(P<0.05)。上述8個因素對淀粉酶活的影響排序為其中淀粉含量>蛋白胨含量>CaCl2含量>NaCl含量>接種量>初始pH>酵母粉含量>FeSO4·7H2O含量,且淀粉含量、蛋白胨含量和CaCl2含量為顯著因素。

    表4 PB設(shè)計實驗結(jié)果

    注:X1:淀粉含量;X2:蛋白胨含量;X3:虛擬因素1;X4:虛擬因素2;X5:酵母粉含量;X6:虛擬因素3;X7:CaCl2含量;X8:FeSO4·7H2O含量;X9:NaCl含量;X10:接種量;X11:初始pH。

    Note:X1:starch;X2:peptone;X3:the virtual factors 1;X4:the virtual factors 2;X5:yeast extract;X6:the virtual factors 3;X7:CaCl2;X8:FeSO4·7H2O;X9:NaCl content;X10:inoculum size;X11:initial pH.

    表5 PB設(shè)計各因數(shù)效應(yīng)分析

    注:*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01),下同。

    Note:*means significant difference atP<0.05,**means extremely significant difference atP<0.01,the same as below.

    由上述 Plackett-Burman 試驗得到的回歸方程為:

    淀粉酶活=261.03+15.58A+12.41B-0.13E+128.74G+1.33H+1.81J+3.95K-3.59L

    其中A為淀粉含量,B為蛋白胨含量,E為酵母粉含量,G為CaCl2含量,H為FeSO4·7H2O含量,J為NaCl含量,K為接種量,L為初始pH。方程擬合的相關(guān)性為R2=98.71%,表明此多項式方程很好地模擬和解釋了 Plackett-Burman 的試驗結(jié)果。

    2.3 最陡爬坡試驗

    最陡爬坡法可以確定主要影響因素的水平,以其試驗值變化的梯度方向為爬坡方向,根據(jù)各因素效應(yīng)值的大小確定變化步長,能快速、經(jīng)濟地逼近最佳值區(qū)域[12]。最陡爬坡試驗結(jié)果見表6。由表6可知,淀粉含量為16 g/L,蛋白胨含量為22 g/L,CaCl2含量為0.6 g/L時,實驗組合4的響應(yīng)值(淀粉酶活)達到最高,此后淀粉酶活開始降低,這說明適當增加培養(yǎng)基中碳源、氮源以及金屬離子的含量有助于菌體的產(chǎn)酶,但過多的添加反而造成不利影響,因此選擇適宜的添加量尤為重要。選取實驗號4試驗組合中各種因素水平作為后續(xù)Box-Behnken試驗設(shè)計的中間點。

    表6 最陡爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果

    2.4 Box-Behnken中心組合設(shè)計

    響應(yīng)面法可通過較少的試驗,較短的周期在整個區(qū)域內(nèi)給出因素與響應(yīng)值之間的明確函數(shù)關(guān)系,且精度更高,同時能夠研究幾種因素間的交互作用。根據(jù)最陡爬坡試驗篩選出的試驗中心點,采用Box-Behnken試驗設(shè)計,利用Design Expert 10軟件進行3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗,試驗設(shè)計及結(jié)果見表7。建立以淀粉酶活為目標函數(shù)的二次回歸方程,并對所得到的回歸方程進行方差分析與顯著性檢驗,結(jié)果見表6。使用Design-Expert軟件進行分析,得到一個3元2次方程:

    Y=-1 509.26+96.41A+83.43B+2 577.94C-0.38AB-28.58AC-3.68BC-1.96A2-1.73B2-1 885.86C2

    方程中,A為淀粉含量,B為蛋白胨含量,C為CaCl2含量。方程中正號表示協(xié)同效應(yīng),而負號表示拮抗效應(yīng)[13,14]。該方程的R2=0.916 3,表明模型能解釋91.63%淀粉酶產(chǎn)量的變化,回歸擬合程度較好。模型的ANOVA結(jié)果見表8。其中模型的P>F值=0.000 3,說明該模型是一個顯著并十分有效的模型。從ANOVA還可以看出淀粉和CaCl2在模型中是影響最為顯著的因素。

    表7 BBD響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果

    表8 響應(yīng)面二次方程模型的ANOVA值

    圖8分別表示了淀粉含量和蛋白胨含量、淀粉含量和CaCl2含量、蛋白胨含量和CaCl2含量的等高線圖和3D圖,各培養(yǎng)基成分的含量對應(yīng)的響應(yīng)值都是隨著培養(yǎng)基成分的含量的提高先升高后降低。根據(jù)上述分析和軟件的預(yù)測,Bacilluskoreensis的最優(yōu)培養(yǎng)基組合為淀粉含量18.74 g/L,蛋白胨含量21.56 g/L,CaCl2含量0.52 g/L,預(yù)測的最高酶活為964.31 U/mL。為驗證模型預(yù)測的可靠性,用預(yù)測的最優(yōu)培養(yǎng)基條件下進行3次平行試驗,得出酶活的實際平均值為959.39±22.34,與響應(yīng)面擬合所得的方程預(yù)測值符合良好,說明該模型可以很好的模擬Bacilluskoreensis的產(chǎn)酶效率。

    3 結(jié)論

    生物酶法降解淀粉因為條件溫和、易于操作、改善效果明顯,在實際應(yīng)用中具有一定優(yōu)勢,可將淀粉分解成低聚糖、半乳糖醛酸、還原糖等,減少煙草原料的刺激性和雜氣,改善吸食品質(zhì),提高其在煙草行業(yè)中的使用價值[15]。生物酶法所使用的酶主要有商品酶和菌株發(fā)酵提取的酶,產(chǎn)淀粉菌株主要有解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、米根霉等[16],這些高效的菌株大多不是從煙葉表面分離得到。本研究從全國多個產(chǎn)地片煙篩選得到的Bacilluskoreensis來源于煙葉表面,與煙草的煙香能較好的契合,對可溶性淀粉、直鏈淀粉、支鏈淀粉都有較強的降解能力,能有效協(xié)調(diào)煙草的化學成分、減少刺激、增加煙香,有很廣泛的應(yīng)用前景。

    本研究通過單因素試驗、PB設(shè)計、最陡爬坡試驗和BBD響應(yīng)面設(shè)計對Bacilluskoreensis的培養(yǎng)基進行了系統(tǒng)的優(yōu)化。BBD響應(yīng)面設(shè)計較之傳統(tǒng)的線性回歸和正交試驗有周期短、試驗次數(shù)少、精度高等優(yōu)勢,因此在微生物發(fā)酵中得到廣泛的應(yīng)用[17]。該方法先通過PB設(shè)計選出影響酶活的最顯著因素為淀粉、蛋白胨和CaCl2,再通過最陡爬坡設(shè)計試驗逼近響應(yīng)面的中心點,最后通過BBD響應(yīng)面設(shè)計得出最優(yōu)的培養(yǎng)基配方。驗證試驗得出酶活的實際平均值為959.39±22.34 U/mL,較之初始酶活提高了69.67%,大幅度提高了淀粉酶活和片煙處理效率,為進一步微生物酶制劑的工業(yè)化應(yīng)用提供了材料基礎(chǔ)。故下一步研究將在本研究的基礎(chǔ)上,研究Bacilluskoreensis的發(fā)酵罐條件(溶氧、轉(zhuǎn)速、pH調(diào)節(jié)等)和該淀粉酶的酶學性質(zhì)、分子量等,并通過硅藻土過濾、膜過濾等方法進一步精制酶液。本研究開發(fā)的酶制劑天然高效、感官評吸配伍性強,為卷煙生產(chǎn)企業(yè)提高上部葉的可用性和提高煙草品質(zhì)提供一條新的方向并奠定了良好的基礎(chǔ)。

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