菊芋粕菊粉的酶法提取、組成及抗氧化活性研究

王曉喜，李 雁，李國強(qiáng)，陳 琦，喬亞俊，杜玉枝，李天才*，畢宏濤*

1中國科學(xué)院西北高原生物研究所 青海省藏藥藥理學(xué)與安全性評價(jià)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810000；2中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

菊芋(HelianthustuberosusL.)系菊科向日葵屬植物，菊粉是其主要的干物質(zhì)組成成分，含量占比超過干物質(zhì)重量的60%[1]。菊芋是我國菊粉工業(yè)化生產(chǎn)的主要原料，目前其工業(yè)化提取技術(shù)以連續(xù)熱水浸提法為主[2]。菊芋菊粉生產(chǎn)過程產(chǎn)生大量的廢棄物——菊芋粕，其濕重約占原料重量的65%，大多作為飼料直接出售[3]。由于菊芋粕中含有大量的糖類物質(zhì)[4]，主要包括果膠和未提取完全的菊粉[5]，所以為了充分利用菊芋資源，提高菊芋產(chǎn)品的附加值，菊芋粕的再次利用越來越受到業(yè)界的關(guān)注。目前，菊芋粕再利用研究主要集中于果膠、果糖和蛋白質(zhì)等成分的提取技術(shù)[6]。由于菊芋粕中含有大量的果膠，而難溶性原果膠所形成的細(xì)胞骨架，嚴(yán)重妨礙了菊芋粕中菊粉的提取，所以尚缺少菊芋粕菊粉的高效提取技術(shù)，造成菊芋菊粉的整體產(chǎn)率無法有效提升。本研究針對菊芋粕菊粉提取效率低的難題，采用果膠酶輔助提取方法對菊芋粕菊粉的高效提取技術(shù)進(jìn)行研究，并對菊芋粕菊粉的抗氧化能力進(jìn)行評價(jià)，以期為菊芋粕的再利用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮菊芋塊莖，甘肅白銀熙瑞生物工程有限公司提供；果膠標(biāo)準(zhǔn)品，購自北京索來寶科技有限公司；D-半乳糖醛酸，水溶性維生素E(Trolox)、二苯基苦基苯肼(DPPH)，購自美國Sigma-Aldrich公司；蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖標(biāo)準(zhǔn)品，購自西寶生物科技(上海)股份有限公司；果膠酶(CAS號:9032-75-1)，自南寧東恒華道生物科技有限公司；2,2-聯(lián)氨基雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽(ABTS二胺鹽)，購自生工生物工程(上海)股份有限公司；辣根過氧化物酶(HRP)，購自上海源葉生物科技有限公司；菲啰嗪，購自上海玉博生物科技有限公司；二乙氨乙基纖維素(DEAE纖維素)，上海恒信化學(xué)試劑有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

SJZX多功能酶標(biāo)儀，珀金埃爾儀器有限公司；FDU-1100型冷凍干燥機(jī)，EYELA東京理化器械株式會社；Mettler Toledo AL104分析天平，瑞士Mettler-Toledo公司；Sigma 3-18KS離心機(jī)，德國Sigma公司；Milli-Q Academic A10超純水系統(tǒng)，美國Millipore公司；IS50傅里葉變換紅外近紅外-拉曼光譜連用儀，美國thermo公司；LC-10CT液相色譜儀，島津日本公司。

1.3 菊粉的提取及含量測定

新鮮菊芋塊莖切成薄片，按照1∶5(w/w)料液比，沸水中提取1 h，紗布過濾后，分別收集濾液和菊芋粕。濾液濃縮后冷凍干燥，得到初提粗菊粉樣品，-20 ℃保存?zhèn)溆?。新鮮菊芋粕冷凍干燥后，粉碎、過篩，按照料液比1∶20(w/w)，加入含有果膠酶的0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，在一定溫度范圍加熱提取。提取液離心后，收集上清液，測定總糖含量和還原糖含量，計(jì)算非還原糖得率。

果膠酶酶活按照Zhang等[7]方法進(jìn)行測定，以果膠酶每分鐘分解果膠產(chǎn)生1 μmol半乳糖醛酸定義為1個(gè)酶活?？偺呛康臏y定以果糖為標(biāo)準(zhǔn)品采用苯酚-硫酸法，還原糖含量的測定以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品采用二硝基水楊酸(DNS)法，菊粉得率計(jì)算公式如下：

非還原糖得率(%)=(總糖含量-還原糖含

量)/菊芋粕重量×100%

1.4 菊芋粕中菊粉的酶法提取工藝優(yōu)化

以酶加量(U/g)、提取pH、提取溫度、提取時(shí)間4個(gè)因素作為指標(biāo)，先后進(jìn)行單因素試驗(yàn)，確定各因素的適宜提取范圍，然后以各因素的適宜提取范圍作為響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)試驗(yàn)的不同水平進(jìn)行響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)，從而確定最佳提取條件。

1.4.1 pH值對菊粉得率的影響

固定提取條件為提取溫度50 ℃、酶底比6.5 U/g、提取時(shí)間1.5 h，考察不同pH(3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0)對菊粉得率的影響。

1.4.2 提取溫度對菊粉得率的影響

固定提取條件為pH4.5、酶底比6.5 U/g、提取時(shí)間1.5 h，考察不同提取溫度(40、45、50、55、60 ℃)對菊粉得率的影響。

1.4.3 酶底比對菊粉得率的影響

固定提取條件為pH4.5、溫度50 ℃、提取時(shí)間1.5 h，考察不同酶底比條件(0.315、0.625、1.25、2.5、5、10、15、20、40 U/g)對菊粉得率的影響。

1.4.4 提取時(shí)間對菊粉得率的影響

固定條件為pH4.5、溫度50 ℃、酶底比10 U/g，考察不同提取時(shí)間(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h)對菊粉提取率的影響。

1.4.5 菊芋粕中菊粉的酶法提取工藝的響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)(Box-Benhnken中心組合法)實(shí)驗(yàn)，以菊粉得率為響應(yīng)值，各因素的3個(gè)水平采用-1、0、1進(jìn)行編碼(見表1)。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平和編碼

1.5 菊芋菊粉的純化及含量測定

菊芋粕酶法提取的粗菊粉提取液，沸水浴滅活果膠酶后離心去除沉淀，上清液經(jīng)蒸餾水透析(截留分子量500 Da)除鹽后冷凍干燥，得到菊芋粕酶法提取粗菊粉。隨后，初提粗菊粉和菊芋粕酶法提取粗菊粉，分別采用DEAE-纖維素陰離子交換色譜柱(55 cm×10.5 cm i.d.)進(jìn)行純化，收集蒸餾水洗脫部分，凝縮后冷凍干燥，得到純化菊粉樣品，分別命名為初次水提菊粉(primary water-extracted inulin，PWI)和二次酶提菊粉(secondary enzymatic-extracted inulin，SEI)。

純化后菊粉樣品的蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)法測定(牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品)，糖醛酸含量采用間羥基聯(lián)苯法測定(半乳糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品)，菊粉含量測定方法同1.3所述。

1.6 菊粉聚合度的測定

菊粉樣品的聚合度采用疏水相互作用液相色譜法(HILIC)[8]進(jìn)行測定，應(yīng)用分析型麥芽糖基鍵合色譜柱(analytical ‘click’ maltose column，5 μm，100 ?，100× 4.6 mmid，浙江華譜新創(chuàng)科技有限公司)，蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖為標(biāo)準(zhǔn)品，流動(dòng)相為65%乙腈水溶液，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃。

1.7 體外抗氧化活性的測定

總抗氧化能力采用ABTS法測定，樣品總抗氧化能力以Trolox當(dāng)量(TEAC，即每克樣品相當(dāng)于x毫克Trolox，mgTE/g)及ABTS自由基清除率表示[9]；有機(jī)自由基DPPH清除能力，按照Arise等(2016)方法[10]測定；羥基自由基(·OH)清除能力，按照Halliwell等[11]的方法測定；超氧負(fù)離子清除能力，采用NADH-NBT-PMS體系[12]測定；還原力采用FRAP方法[13]測定；二價(jià)鐵離子螯合能力，采用Dinis等[14]的方法測定，EDTA作為陽性對照物。

1.8 數(shù)據(jù)處理

每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)6次，取平均值，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表述。采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的作圖及分析。采用GraphPad Prism 5.0軟件作圖及分析數(shù)據(jù)，one-way ANOVA進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，P<0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果分析

2.1 pH值對菊粉得率的影響

從圖1A可以看出，pH值對菊粉得率影響顯著，菊粉得率隨著pH值升高呈先增加后降低的趨勢，在pH4.5時(shí)，菊粉得率達(dá)到最大值33.16%。這可能是由于在pH4.5時(shí)果膠酶的酶活最高，其造成的細(xì)胞壁中果膠類多糖的破壞促進(jìn)了菊粉成分溶出。

2.2 溫度對菊粉得率的影響

如圖1B所示，在40～60 ℃范圍，菊粉得率隨著溫度的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在50 ℃時(shí)得率最高，菊粉得率為31.76%?？梢姡摐囟认鹿z酶酶活作用與菊粉溶解性共同促進(jìn)了菊芋粕菊粉的溶出。

2.3 酶底比對菊粉得率的影響

如圖1C所示，菊粉得率隨著酶底比的增加呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢。在酶底比0.315～2.5 U/g時(shí)，菊粉得率隨酶底比增加而顯著上升；2.5～20 U/g范圍內(nèi)，菊粉得率變化較小，10 U/g時(shí)菊粉得率最高，達(dá)到35.08%；酶底比大于20 U/g時(shí)，菊粉得率隨酶底比增加而顯著下降。上述結(jié)果可能由于酶底比較低時(shí)，果膠酶未能充分破壞細(xì)胞壁，而在較高酶底比時(shí)，提取液粘度增大造成菊粉不易溶出。

2.4 提取時(shí)間對菊粉得率的影響

如圖1D所示，當(dāng)提取時(shí)間不足1.5 h時(shí)，延長提取時(shí)間可以顯著增加菊粉得率。提取1.5 h時(shí)，菊粉得率為33.1%，繼續(xù)延長提取時(shí)間對菊粉得率的影響較小。

圖1 pH值(A)、提取溫度(B)、酶底比(C)、提取時(shí)間(D)對菊芋粕菊粉得率的影響Fig.1 Effects of pH,extraction temperature,enzyme-substrate ratio and extraction duration on the yield 注：圖中小寫字母表示單因素實(shí)驗(yàn)中具有顯著差異的不同處理組(P<0.05)。Note:Lowercase letters mean a significant difference among the different treatments at P<0.05 level in single factor experiment.

2.5 響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnken中心組合法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以菊粉提取率為響應(yīng)值，以pH值(A)、溫度(B)、酶底比(C)、提取時(shí)間(D)為自變量，建立四因素三水平中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，共包括29個(gè)實(shí)驗(yàn)方案，24個(gè)分析試驗(yàn)點(diǎn)，5個(gè)中心試驗(yàn)點(diǎn)，用來計(jì)算試驗(yàn)誤差。菊芋粕菊粉提取的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

續(xù)表2(Continued Tab.2)

實(shí)驗(yàn)號No.A:pH值pH valueB:溫度Extraction temperature(℃)C:酶底比Enzyme-substrate ratio(U/g)D:提取時(shí)間Extraction time (h)Y:菊粉得率Yield of inulin (%)17-101032.96±0.42181-10031.37±1.1419000035.38±0.482000-1136.91±0.8721010133.06±0.3222000036.75±0.652300-1-134.36±0.542401-1033.46±1.3325011031.52±0.6126000035.24±0.54270-11032.75±0.78280-1-1033.55±1.112910-1033.35±0.33

2.5.1 回歸模型的建立

采用Design-Expert 8.0.6對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，對各因素回歸擬合后，得到回歸方程如下：

Y=35.66-0.077A-0.52B-0.91C+0.59D

+0.79BC+0.79AD-0.76BD-2.05A2

-1.76B2-1.01C2

2.5.2 回歸模型的方差分析

為了確定響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中4個(gè)因素對菊粉提取效果的影響，以及各個(gè)因素的交互作用和顯著性，進(jìn)行回歸方差分析(表3)。結(jié)果表明，失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05)，而模型極顯著(P<0.000 1)，其中R2=0.901 1，說明預(yù)測值和實(shí)際值具有高度的相關(guān)性。通過模擬系數(shù)顯著性性檢驗(yàn)，得到提取因素的主效應(yīng)關(guān)系：A>D>C>B，即酶底比>pH值>提取溫度>提取時(shí)間，因素BD、AB、AD和C2對提取效果顯著，而因素A、B、C、A2、B2、C2對提取效果具有極顯著的影響。

表3 方差分析結(jié)果

續(xù)表3(Continued Tab.3)

方差來源Source平方和Quadratic sum自由度Df均方Mean square F值F-valueP值P-value顯著性SignificanceB221.747 13121.747 1352.759 38< 0.000 1**C27.559 30117.559 30118.339 160.000 8**D20.819 91810.819 9181.989 1510.180 3殘差5.770 725140.412 195失擬4.229 425100.422 9431.097 6260.506 1Not significant誤差1.541 29940.385 325總和84.136 8928

注：**P<0.01為極顯著；*P<0.05為顯著。

Note:**P<0.01was considered to be extremely significant;*P<0.05 was considered to be significant.

2.5.3 響應(yīng)面分析

根據(jù)軟件Design-Expert獲得響應(yīng)值的3D曲面，分析各因素對菊粉得率的影響及各因素之間的交互作用。圖2～7中所示為pH、提取溫度、酶底比、提取時(shí)間中任意兩個(gè)因素為零水平時(shí)，其余兩個(gè)因素間的交互作用對菊粉得率的影響。菊粉的得率隨其中任意兩個(gè)變量的增加均呈上升趨勢，達(dá)到某一定值時(shí)，曲面稍下降或趨于平緩。圖2、4和6曲面陡峭，說明pH和溫度、pH和時(shí)間、溫度和時(shí)間之間交互作用明顯，與方差分析結(jié)果一致。

圖2 pH值和提取溫度對菊粉得率影響的響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface plot for pH value and extraction temperature effect on the yield of inulin

圖3 pH值和酶底比對菊粉得率影響的響應(yīng)面圖Fig.3 Response surface plot for pH value and enzyme-substrate ratio effect on the yield of inulin

圖4 pH值和提取時(shí)間對菊粉得率影響的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface plot for pH value and extraction time effect on the yield of inulin

圖5 提取溫度和酶底比對菊粉得率影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plot for extraction temperature and enzyme-substrate ratio effect on the yield of inulin

2.5.4 參數(shù)優(yōu)化及最優(yōu)條件的驗(yàn)證

在選取的因素范圍內(nèi)，根據(jù)上述回歸模型分析得出，SEI的最佳酶法提取條件為：pH值4.51、提取溫度48.46 ℃、酶底比7.59 U/g、提取時(shí)間2 h。根據(jù)最佳條件和實(shí)際提取條件可操控性，調(diào)整提取條件為：pH4.5、提取溫度50 ℃、酶底比7.5 U/g、提取時(shí)間2 h。經(jīng)3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，測得的SEI得率為35.30%±0.85%，與預(yù)測值36.6%無顯著差別，說明上述模型與實(shí)際情況擬合較好。與傳統(tǒng)熱水浸提法相比(提取條件：料液比1∶20 w/w、提取時(shí)間2 h，提取溫度80 ℃，菊粉得率：25.26%±0.50%)，SEI得率提高38.16%。

圖6 提取溫度和提取時(shí)間對菊粉得率影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface plot for extraction temperature and extraction time effect on the yield of inulin

2.6 初次水提菊粉(PWI)和二次酶提菊粉(SEI)組成成分比較

由于提取順序和提取方式的不同可能會對菊粉的組成產(chǎn)生影響，我們對PWI和SEI的組成成分進(jìn)行了測定。結(jié)果如表4、表5所示，SEI的總糖和菊粉含量均顯著高于PWI(P<0.05)。在菊粉聚合度方面，PWI中蔗果三糖和蔗果四糖含量較高，而SEI中蔗果五糖、蔗果六糖及其以上聚合度菊粉的含量較高。該結(jié)果可能是由于低聚合度菊粉溶解度較大而最先被提取，而聚合度較高的菊粉溶解度較小或受限于果膠等細(xì)胞壁成分束縛而較難被提取。當(dāng)采用果膠酶輔助提取時(shí)，細(xì)胞壁成分被破壞，聚合度較高的菊粉被提取出來。

圖7 酶底比和提取時(shí)間對菊粉得率影響的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface plot for enzyme-substrate ratio and extraction time effect on the yield of inulin

表4 純化菊粉組分的總糖、菊粉、半乳糖醛酸和蛋白質(zhì)含量

注：不同小寫字母表示PWI和SEI之間具有顯著性差異(P<0.05)。

Note:Different lowercase letters indicate a significant difference between PWI and SEI (P<0.05).

表5 純化菊粉組分的聚合度組成分析結(jié)果

注：不同小寫字母表示PWI和SEI之間具有顯著性差異(P<0.05)。

Note:Different lowercase letters indicate a significant difference between PWI and SEI (P<0.05).

2.7 抗氧化活性測定結(jié)果

2.7.1 總抗氧化能力

采用總抗氧化能力法測定ABTS自由基清除能力，Trolox為標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制以Trolox含量X(ng/μL)為橫坐標(biāo)，ABTS自由基清除率Y(%)為縱坐標(biāo)，回歸方程為Y=0.007 5X(R2=0.997 1)。結(jié)果如圖8所示，PWI和SEI的ABTS自由基清除能力均隨著樣品濃度增加而上升。當(dāng)樣品濃度為5 mg/mL時(shí)，SEI的ABTS自由基清除能力顯著優(yōu)于PWI(P<0.05)，二者TEAC值分別為3.93±1.02和2.95±0.47 mg TE/g。

2.7.2 DPPH自由基清除能力

如圖9所示，兩種菊粉樣品的DPPH清除能力均隨著劑量濃度的增加而呈上升趨勢。在0～0.4 mg/mL濃度范圍內(nèi)，SEI的DPPH清除能力優(yōu)于PWI，但是在0.4～0.6 mg/mL濃度范圍時(shí)二者差異發(fā)生反轉(zhuǎn)，0.6～1.0 mg/mL時(shí)PWI的DPPH清除能力顯著優(yōu)于SEI。1.0 mg/mL濃度時(shí)，PWI和SEI的DPPH清除率分別為15.1%±0.139%和10.6%±0.76%。

圖8 初次水提菊粉(PWI)和二次酶提菊粉(SEI)的總抗氧化能力Fig.8 Total antioxidant capacities of primary water-extracted inulin (PWI) and secondary enzymatic-extracted inulin (SEI).注：不同小寫字母表示PWI和SEI之間具有顯著性差異(P<0.05)。Note:Different lowercase letters indicate a significant difference between PWI and SEI (P<0.05).

圖9 初次水提菊粉(PWI)和二次酶提菊粉(SEI)的DPPH自由基清除率測定結(jié)果Fig.9 DPPH-scavenging activities of primary water-extracted inulin (PWI) and secondary enzymatic-extracted inulin (SEI).注：不同小寫字母表示PWI和SEI之間具有顯著性差異(P<0.05)。Note:Different lowercase letters indicate a significant difference between PWI and SEI (P<0.05).

2.7.3 羥基自由基(·OH)清除能力

如圖10所示，兩種菊粉樣品的·OH清除率均隨著濃度的增加而上升。在1～5 mg/mL濃度范圍內(nèi)，PWI的·OH清除率為1.58%～18.01%，SEI的·OH清除率為1.15%～19.32%。在1和4 mg/mL濃度時(shí)，PWI清除能力顯著高于SEI(P<0.05)；5 mg/mL時(shí)，SEI清除能力顯著高于PWI(P<0.05)。

2.7.4 超氧負(fù)離子清除能力

如圖11所示，兩種菊粉樣品的超氧負(fù)離子清除能力均隨著劑量濃度的增加而增強(qiáng)，但是SEI比PWI的超氧負(fù)離子清除能力增強(qiáng)幅度更加顯著。在1 mg/mL濃度時(shí)，PWI的超氧負(fù)離子清除能力顯著優(yōu)于SEI，而3～5 mg/mL濃度時(shí)，SEI的超氧負(fù)離子清除能力顯著優(yōu)于PWI。5 mg/mL濃度時(shí)，PEI和SEI的超氧負(fù)離子清除率分別為16.47%±0.25%和20.15%±0.68%(P<0.05)。

圖10 初次水提菊粉(PWI)和二次酶提菊粉(SEI)的·OH清除能力Fig.10 Hydroxyl radical-scavenging activities of primary water-extracted inulin (PWI) and secondary enzymatic-extracted inulin (SEI).注：不同小寫字母表示PWI和SEI之間具有顯著性差異(P<0.05)。Note:Different lowercase letters indicate a significant difference between PWI and SEI (P<0.05).

圖11 初次水提菊粉(PWI)和二次酶提菊粉(SEI)的超氧負(fù)離子清除能力Fig.11 Superoxide anion scavenging activities of primary water-extracted inulin (PWI) and secondary enzymatic-extracted inulin (SEI).注：不同小寫字母表示PWI和SEI之間具有顯著性差異(P<0.05)。Note:Different lowercase letters indicate a significant difference between PWI and SEI (P<0.05).

2.7.5 Fe2+螯合能力

如圖12所示，SEI的Fe2+螯合能力呈濃度劑量依賴關(guān)系，隨著濃度的增加而上升。在5 mg/mL時(shí)，其Fe2+螯合率達(dá)到15.02±0.50%。然而，PWI未表現(xiàn)出Fe2+螯合能力。

2.7.6 還原力

如圖13所示，兩種菊粉樣品的還原力隨濃度增加而增強(qiáng)。在樣品濃度為5 mg/mL時(shí)，二者的還原力達(dá)到了最大值，其中PWI的還原力顯著優(yōu)于SEI，700 nm時(shí)二者的吸光度分別為0.129±0.006和0.083±0.006(P<0.05)。

圖12 初次水提菊粉(PWI)和二次酶提菊粉(SEI)的Fe2+螯合能力Fig.12 Fe2+chelation abilities of primary water-extracted inulin (PWI) and secondary enzymatic-extracted inulin (SEI)

圖13 初次水提菊粉(PWI)和二次酶提菊粉(SEI)的還原力Fig.13 Reducing power of primary water-extracted inulin and secondary enzymatic-extracted inulin.注：不同小寫字母表示PWI和SEI之間具有顯著性差異(P<0.05)。Note:Different lowercase letters indicate a significant difference between PWI and SEI (P<0.05).

3 結(jié)論

菊粉是由D-果糖經(jīng)β-l,2糖苷鍵連接而成的線性直鏈狀多糖，末端常含一個(gè)葡萄糖殘基。歐洲的菊粉工業(yè)化生產(chǎn)以菊苣為原料，在我國則以菊芋為原料。我國開展菊芋菊粉研究的起步較晚，且無法應(yīng)用歐洲的菊苣工業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)，因此導(dǎo)致了菊芋菊粉生產(chǎn)工藝相對落后。目前，我國菊芋菊粉的工業(yè)生產(chǎn)大多采用甜菜制糖的提取設(shè)備和生產(chǎn)工藝。魏凌云等采用響應(yīng)面法對菊芋菊粉的熱水浸提工藝進(jìn)行了優(yōu)化，在自然pH值、溫度為76.7 ℃、液固比為 10.56∶1(v/w)、提取時(shí)間20 min的最佳工藝條件下，菊粉提取率達(dá)到83.6%[15]。胡建鋒等采用超聲波輔助提取技術(shù)對菊粉熱水提取工藝進(jìn)行改進(jìn)，菊粉得率達(dá)到 63.37%[16]。上述熱水浸提生產(chǎn)菊芋菊粉的過程中，產(chǎn)生了大量的工業(yè)廢棄物-菊芋粕。菊芋粕中仍含有果膠、菊粉、纖維素/半纖維素等大量糖類化合物，其中菊粉含量最多可達(dá)到6%。因此，從菊芋粕中深層提取菊粉，有望在不改變原有菊粉生產(chǎn)工藝的條件下，以較低成本解決國內(nèi)企業(yè)菊芋菊粉提取效率低的產(chǎn)業(yè)化瓶頸問題。目前，研究人員已經(jīng)開始關(guān)注菊芋粕的高效利用，已有關(guān)于菊芋粕中果膠和單糖的二次利用研究的報(bào)道[1,8]，但是還沒有關(guān)于菊芋粕中菊粉提取技術(shù)的報(bào)道。

本研究以菊芋粕為研究材料，采用酶法提取技術(shù)對其中殘留菊粉進(jìn)行深層提取，提高殘余菊粉的提取效率，并對PWI和SEI的組成和抗氧化活性進(jìn)行比較研究，初步探討提取方式和順序?qū)辗劢M成和活性的影響。結(jié)果表明，采用響應(yīng)面法優(yōu)化的果膠酶輔助提取菊粉的最佳工藝(pH值4.5、提取溫度50 ℃、酶底比7.5 U/g、提取時(shí)間2 h)，菊芋粕菊粉的得率比傳統(tǒng)熱水浸提法提高38.16%。已有研究發(fā)現(xiàn)，提取方法能夠影響多糖的抗氧化活性，特別是酶法提取多糖較傳統(tǒng)熱水水提多糖具有更強(qiáng)的抗氧化能力[19,20]。同樣，本研究結(jié)果表明，SEI的抗氧化活性優(yōu)于PWI。體外抗氧化活性評價(jià)方法涉及到自由基鏈反應(yīng)的引發(fā)、傳遞與終止每個(gè)環(huán)節(jié)，并且測得不同體外抗氧化活性評價(jià)方法之間的抗氧化活性基本趨勢一致。二者產(chǎn)生抗氧化能力差異的原因推測可能有2個(gè)方面：(1)SEI羥基等活性基團(tuán)暴露量較多，易與自由基充分作用，進(jìn)而能將更多的自由基轉(zhuǎn)變成穩(wěn)定的物質(zhì)，終止自由基的鏈反應(yīng)；(2)SEI中高聚合度菊粉含量較高，粘度較大，易于結(jié)合那些能與H2O2反應(yīng)的金屬離子，形成螯合物，從而遏抑羥基自由基的產(chǎn)生[21]。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)果膠酶酶法提取技術(shù)能夠顯著增加菊芋粕菊粉的得率，且酶法提取菊芋粕菊粉(SEI)與熱水初次提取菊芋菊粉(PWI)相比抗氧化能力更強(qiáng)。因此，果膠酶輔助提取方法有望為菊芋粕菊粉的高效利用問題提供新的解決思路。