青蒿琥酯脂質(zhì)體的制備及抗腫瘤作用研究

蘇玉嬌，周 雙，孫文璐，何 媛，劉 凱*，王永軍*

青蒿琥酯脂質(zhì)體的制備及抗腫瘤作用研究

蘇玉嬌1，周 雙1，孫文璐1，何 媛2，劉 凱2*，王永軍1*

（1. 沈陽藥科大學(xué) 無涯學(xué)院，遼寧 沈陽 110016；2. 江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司 研究院，江蘇 連云港 222047）

制備青蒿琥酯脂質(zhì)體，對其抗腫瘤作用進行研究。通過醋酸鈣梯度法制備青蒿琥酯脂質(zhì)體，考察制備的脂質(zhì)體的粒徑、物理穩(wěn)定性、體外釋放、體內(nèi)藥動學(xué)及藥效學(xué)。制備的青蒿琥酯脂質(zhì)體呈類球形，粒徑為(134.8 ± 2.654) nm，PDI為7.8×10-2± 5.1×10-2，zeta電位為 (-19.4 ± 1.57) mV，包封率在95%左右。在4 ℃條件下放置40 d穩(wěn)定性良好，體外釋放實驗表明青蒿琥酯脂質(zhì)體具有緩釋作用，藥動學(xué)實驗證明青蒿琥酯脂質(zhì)體的體內(nèi)消除半衰期（1/2）和藥時曲線下面積（AUC0-t）分別是青蒿琥酯溶液劑組的4.6倍和9.2倍。藥效學(xué)實驗表明與青蒿琥酯溶液劑組相比，青蒿琥酯脂質(zhì)體組具有顯著的抗腫瘤效果，且安全性良好。青蒿琥酯脂質(zhì)體能顯著延長青蒿琥酯的體內(nèi)半衰期，提高生物利用度，增強青蒿琥酯的抗腫瘤效果。

藥劑學(xué)；脂質(zhì)體；醋酸鈣梯度；青蒿琥酯；藥代動力學(xué)；抗腫瘤

青蒿琥酯（artesunate，ARS，圖1）是青蒿素的衍生物，是一種有效的抗瘧藥，還具有抗炎[1]、抗纖維化[2]和免疫調(diào)節(jié)[3]等作用。一系列體內(nèi)和體外實驗表明，青蒿琥酯對胰腺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌和肺癌細胞等具有殺傷作用[4]，且耐受性良好，不具有耐藥性，對一些易出現(xiàn)多藥耐藥的腫瘤細胞也具有一定的抑制作用。青蒿琥酯發(fā)揮抗腫瘤作用的機制主要有過氧橋產(chǎn)生有毒的自由基、細胞周期停滯、誘導(dǎo)細胞凋亡和抑制腫瘤血管生成[5]。但由于其水中溶解度較低[6]，結(jié)構(gòu)中的過氧橋不穩(wěn)定，且體內(nèi)半衰期短[7]，大大限制了其應(yīng)用。

Fig. 1 The chemical structure of artesunate (ARS)

脂質(zhì)體作為一種納米藥物載體，具有被動靶向性、且能提高藥物的穩(wěn)定性、增加難溶性藥物的溶解度、降低藥物的毒性和控制藥物的釋放速率[8]等優(yōu)點。將脂質(zhì)體表面進行PEG化修飾制備成長循環(huán)脂質(zhì)體，可以顯著提高藥物的半衰期，延長脂質(zhì)體在體內(nèi)的循環(huán)時間，提高藥物的療效[9-10]。醋酸鈣梯度法用于包載弱酸性藥物，青蒿琥酯結(jié)構(gòu)中含有一個羧基，pKa大約在4左右，顯弱酸性[11]。但青蒿琥酯溶解度較低，所以需要采用溶劑輔助法幫助其載藥，即載藥時向脂質(zhì)體中加入乙醇，乙醇不僅能夠增加青蒿琥酯的溶解度，而且可以提高磷脂雙分子膜的滲透性，幫助青蒿琥酯透過磷脂雙分子膜進入脂質(zhì)體內(nèi)水相中[12]。

作者采用薄膜分散-主動載藥法制備了青蒿琥酯長循環(huán)脂質(zhì)體，體外釋放實驗表明脂質(zhì)體能夠延緩藥物的釋放，體內(nèi)藥動學(xué)證明脂質(zhì)體能夠延長藥物的半衰期，藥效學(xué)實驗證明與青蒿琥酯溶液劑相比，脂質(zhì)體能顯著提高其抗腫瘤效果。

1 儀器與材料

RE-5203旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），擠出整粒機（安拓思納米技術(shù)有限公司），Malvern Zetasizer粒徑分析儀（英國Malvern公司），超濾離心管（美國Millipore公司），聚碳酸酯膜（英國Whatman公司），透析袋（MWCO 1.2×104～1.4×104u，上海綠鳥科技發(fā)展有限公司），高效液相色譜儀（日本Hitachi公司），ACQUITY UPLCTM/Tandem Quadrupole Detector（TQD）超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（MassLynx 4.1工作站，美國Waters公司），Model 500酶標儀（美國BioRed公司），Phenomenex C18色譜柱（美國Phenomenex公司）。

青蒿琥酯（artesunate，ARS，大連美侖生物技術(shù)有限公司），DSPC、膽固醇（Chol）、mPEG2000- DSPE（上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司），瓊脂糖凝膠（Sephadex G-50，北京索萊寶科技有限公司），RPMI 1640培養(yǎng)液（美國GIBCO公司），胰酶、青霉素、鏈霉素（美國Amresco公司），胎牛血清（美國Hyclone公司）。

Sprague-Dawley 大鼠，雄性，體質(zhì)量220～250 g，沈陽藥科大學(xué)動物中心提供，動物許可證號 SCXK（遼）2015-0001。Balb/C小鼠，雌性，體質(zhì)量18～22 g，沈陽藥科大學(xué)實驗動物中心提供，動物許可證號 SCXK（遼）2015-0001。鼠源乳腺癌4T1細胞（南京科佰生物科技有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 青蒿琥酯長循環(huán)脂質(zhì)體的制備

將DSPC、Chol和mPEG2000-DSPE溶解于10 mL乙醇中，65 ℃減壓蒸發(fā)成均勻的薄膜。加入200 mmol?L-1醋酸鈣溶液8 mL，65 ℃水化30 min，制備空白脂質(zhì)體。制備好的空白脂質(zhì)體于70 ℃下分別通過0.4 μm、0.2 μm和0.1 μm的聚碳酸酯膜擠出10次。然后通過Sephadex G-50凝膠柱色譜將空白脂質(zhì)體外水相的200 mmol?L-1醋酸鈣溶液替換成200 mmol?L-1硫酸鈉溶液來形成梯度脂質(zhì)體。

在空白脂質(zhì)體中加入10 g?L-1青蒿琥酯乙醇溶液，于55 ℃孵育30 min，冰浴10 min終止載藥，即得青蒿琥酯長循環(huán)脂質(zhì)體。將制得的青蒿琥酯脂質(zhì)體于40 ℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇。

2.2 脂質(zhì)體的粒徑和zeta電位分析

青蒿琥酯脂質(zhì)體用蒸餾水稀釋至適宜濃度后，用Malvern Zetasizer粒徑分析儀來測定脂質(zhì)體的粒徑、PDI和zeta電位。

由圖2及表1可知，青蒿琥酯脂質(zhì)體的粒徑在130 nm左右， PDI小于0.2，說明脂質(zhì)體的粒徑分布較均勻。脂質(zhì)體表面較高的負電產(chǎn)生靜電排斥作用，避免了脂質(zhì)體之間發(fā)生聚集現(xiàn)象，有利于脂質(zhì)體的物理穩(wěn)定性，包封率在95%左右。

Fig. 2 The size distribution(A) and TEM(B) of ARS-LPs

Table 1 Characterization of ARS-LPs (n = 3)

2.3 液相色譜條件

色譜柱：Kromasil 100-5 C18柱(150 mm × 4.6 mm，5 μm)；柱溫：30 ℃；檢測波長：216 nm；流動相：乙腈-水（含體積分數(shù)0.1%磷酸）（體積比50∶50）；流速：1 mL?min-1；進樣量：20 μL。

2.4 脂質(zhì)體包封率的測定

使用超濾離心法對青蒿琥酯脂質(zhì)體的包封率進行測定。首先，取青蒿琥酯脂質(zhì)體300 μL加入截留分子質(zhì)量為1×104u的超濾離心管上部，3 000 r?min-1離心30 min，使得脂質(zhì)體被截留在超濾管上部，而未包載的游離藥物被離心至超濾管底部。向底部液體加入2 mL異丙醇-水（體積比80∶20），采用高效液相色譜法測定青蒿琥酯質(zhì)量濃度（1）。另外取青蒿琥酯脂質(zhì)體300 μL，加入異丙醇-水（體積比80∶20）2 mL，采用高效液相色譜法測定青蒿琥酯質(zhì)量濃度（2）。根據(jù)公式EE=1-1/2×100%計算包封率。

2.5 青蒿琥酯脂質(zhì)體的穩(wěn)定性考察

將青蒿琥酯脂質(zhì)體放置于4 ℃冰箱中，在規(guī)定的時間取樣并測定其粒徑、PDI和包封率。由圖3可知，青蒿琥酯在4 ℃放置40 d內(nèi)，粒徑仍保持在130 nm左右，PDI小于0.2，包封率變化不明顯，說明青蒿琥酯脂質(zhì)體在4 ℃下40 d內(nèi)的物理穩(wěn)定性良好。

A—Changes of particle size and PDI;1—Particle size; 2—PDI; B—Changes of wEE

2.6 青蒿琥酯脂質(zhì)體的體外釋放行為

采用透析法。取青蒿琥酯脂質(zhì)體2 mL置于透析袋中，將透析袋兩端扎緊，浸沒于30 mL含體積分數(shù)20%乙醇的pH值7.4 PBS的錐形瓶中，置于37 ℃、100 r?min-1恒溫水浴振蕩器中，分別于規(guī)定時間點取樣1 mL，并隨即補加1 mL新鮮的空白釋放介質(zhì)，按“2.3”條色譜條件測定青蒿琥酯的含量，并計算青蒿琥酯的累積釋放度。脂質(zhì)體體外釋放實驗結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，ARS solution 在前8 h 就已經(jīng)釋放了90%左右，ARS-LPs的釋放速率明顯慢于ARS solution，ARS-LPs在24 h內(nèi)僅釋放了39%的ARS，且不存在突釋現(xiàn)象和藥物降解現(xiàn)象，表明脂質(zhì)體的雙分子膜能大大延緩青蒿琥酯的釋放速率，具有緩釋作用。

Fig. 4 In vitro release of ARS solution and ARS LPs ( n = 3)

2.7 青蒿琥酯脂質(zhì)體的體內(nèi)藥動學(xué)行為

8只SD大鼠禁食12 h，自由飲水，實驗前稱質(zhì)量并隨機分為2組，每組4只，分別尾靜脈注射給予ARS solution和ARS LPs，給藥劑量為10 mg?kg-1。并于給藥后0.083、0.5、1、2、4、6、8、12和24 h眼眶取血0.4 mL，置于已涂肝素的離心管中，1.5×104r?min-1離心5 min，取上層血漿保存于-80 ℃冰箱備用。

采用沉淀蛋白法處理血漿樣品。取血漿樣品50 μL，加入甲醇50 μL（含體積分數(shù)0.5%冰醋酸及體積分數(shù)0.6%過氧化氫）和250 μg?L-1地西泮內(nèi)標30 μL，渦旋30 s，加入100 μL甲醇（含體積分數(shù)0.5%冰醋酸及體積分數(shù)0.6%過氧化氫），渦旋3 min，1.5×104r?min-1離心5 min，取上清，1.5×104r?min-1離心5 min，取上清進樣。

采用DAS 2.0軟件計算藥動學(xué)參數(shù)。藥動學(xué)曲線如圖5所示，游離的青蒿琥酯在血漿中快速消除，4 h 就已經(jīng)檢測不到了；而脂質(zhì)體中青蒿琥酯的消除速率較慢，在各個時間點的血藥濃度均高于青蒿琥酯溶液劑，表明脂質(zhì)體能夠增加青蒿琥酯在血漿中的穩(wěn)定性，延長青蒿琥酯在血液中的循環(huán)時間。通過DAS軟件求得的藥動學(xué)參數(shù)見表2，與青蒿琥酯溶液劑相比，青蒿琥酯脂質(zhì)體的1/2增加了4.6倍，MRT(0-t)提高了20 倍，AUC0-t提高了 9.2倍，CLz降低了9.4倍。

Fig. 5 Plasma concentration-time profiles of ARS solution and ARS LPs after a single intravenous administration (10 mg?kg-1, mean ± SD, n = 4)

Table 2 Pharmacokinetics parameters of ARS solution and ARS LPs after intravenous administration at a dose of 10 mg?kg-1 (n = 4)

2.8 青蒿琥酯脂質(zhì)體的體內(nèi)抗腫瘤效果

將生長狀態(tài)良好的4T1細胞接種于Balb/C小鼠右后側(cè)腰背部皮下組織內(nèi)，建立鼠源乳腺癌腫瘤模型。當(dāng)腫瘤體積達到150 mm3左右時，將小鼠隨機分為4組（= 6）：A組為生理鹽水組；B組為ARS溶液劑組，給藥劑量為15 mg?kg-1；C組為ARS脂質(zhì)體低劑量組，給藥劑量為15 mg?kg-1；D組為ARS脂質(zhì)體高劑量組，給藥劑量為45 mg?kg-1。尾靜脈注射給藥，隔一天給藥1次，每天測量小鼠體質(zhì)量和腫瘤體積，按照下列公式計算腫瘤體積：=×2/2，其中為腫瘤的長徑，為腫瘤的短徑。

組間統(tǒng)計學(xué)差異采用Student’s-test 進行檢驗，< 0.05 表示具有顯著性差異。

腫瘤生長曲線如圖 6所示，生理鹽水組不能抑制腫瘤生長，9 d后腫瘤體積達到1 100 mm3左右。相比之下，ARS solution 和ARS-LPs低劑量（15 mg?kg-1）對腫瘤的生長有一定的抑制作用，在相同劑量條件下，ARS-LPs的抗腫瘤效果好于ARS solution。ARS-LPs高劑量（45 mg?kg-1）表現(xiàn)出更明顯的抑制腫瘤生長的作用，能將腫瘤體積維持在400 mm3以下。

■—Saline; ?—ARS solution (15 mg?kg-1); ?—ARS LPs (15 mg?kg-1); ?—ARS LPs (45 mg?kg-1); ***—P <0.001

每天測量小鼠的體質(zhì)量變化，繪制小鼠的體質(zhì)量變化曲線，結(jié)果見圖 7。結(jié)果表明，生理鹽水組、ARS solution組和ARS-LPs低劑量組（15 mg?kg-1）體質(zhì)量均未有明顯下降，ARS-LPs高劑量（45 mg?kg-1）組體質(zhì)量有輕微下降，但不明顯。藥效學(xué)實驗結(jié)果表明與青蒿琥酯溶液劑相比，青蒿琥酯脂質(zhì)體的抗腫瘤效果更好，且安全性良好。

■—Saline; ?—ARS solution (15 mg?kg-1); ?—ARS LPs (15 mg?kg-1);?—ARS LPs (45 mg?kg-1); ***P <0.001

3 討論

a. 中草藥脂質(zhì)體的研究是中藥領(lǐng)域的研究熱點之一，探索將中藥脂質(zhì)體應(yīng)用于抗腫瘤具有很好的發(fā)展前景[13]。青蒿衍生物大多采用被動載藥法制備成脂質(zhì)體，包封率較低。青蒿琥酯顯弱酸性，本研究中探索通過醋酸鈣梯度法將青蒿琥酯包封入脂質(zhì)體。在醋酸鈣梯度法中（圖8），脂質(zhì)體內(nèi)外水相pH梯度是驅(qū)使ARS載入脂質(zhì)體內(nèi)水相的關(guān)鍵。內(nèi)水相中存在下面平衡：

由于AcOH（P = 6.6×10-4）的跨膜速度是Ca2+（P = 2.5×10-11）的107倍，因此脂質(zhì)體內(nèi)水相中的AcO-轉(zhuǎn)為化AcOH后可跨到脂質(zhì)體外水相中，使得平衡向右進行，在此基礎(chǔ)上也就形成了外酸內(nèi)堿的跨膜pH梯度。Ca2+可以和包封到脂質(zhì)體內(nèi)水相的弱酸性藥物形成溶解度更低的復(fù)合物，相當(dāng)于從內(nèi)外相平衡中消除了內(nèi)水相中的弱酸分子，在脂質(zhì)體內(nèi)水相形成了漏槽條件，使弱酸性藥物不斷地從外水相進入內(nèi)水相并累積在脂質(zhì)體內(nèi)部。Ca2+可以看作是一個儲庫，在相當(dāng)長的時間內(nèi)維持穩(wěn)定的跨膜pH梯度。載藥過程中加熱會使脂質(zhì)體由“膠晶態(tài)”變?yōu)椤耙壕B(tài)”，脂質(zhì)雙分子膜流動性增加，排列變得無序，乙醇的存在也會增加脂質(zhì)膜的滲透性，脂質(zhì)體外水相的乙醇將ARS完全溶解，使ARS以分子形式穿過磷脂雙分子層進入內(nèi)水相中。內(nèi)水相中的堿性環(huán)境使ARS去質(zhì)子化并以離子形式穩(wěn)定包載在脂質(zhì)體內(nèi)水相中。通過主動載藥法能夠提高脂質(zhì)體包封率和穩(wěn)定性，使其發(fā)揮更好的抗腫瘤效果。

b.脂質(zhì)體能夠增加青蒿琥酯的消除半衰期，延長在血液中的循環(huán)時間，提高生物利用度。分析原因有兩個：一個是脂質(zhì)體雙分子膜能夠延緩藥物的釋放；二是對脂質(zhì)體進行PEG化能夠有效避免網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（RES）的識別和攝取。

c. 藥效學(xué)實驗結(jié)果表明，脂質(zhì)體能夠增強青蒿琥酯的抗腫瘤效果，作者制備的青蒿琥酯長循環(huán)脂質(zhì)體，在抗腫瘤方面具有廣闊的發(fā)展前景，為后續(xù)對青蒿琥酯的探索提供了一定的參考價值。

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Preparation and antitumor effect evaluation of artesunate liposomes

SU Yujiao1, ZHOU Shuang1, SUN Wenlu1, HE Yuan2, LIU Kai2*, WANG Yongjun1*

(1.,,110016，；2.,.,，222047,)

To prepare artesunate liposomes (ARS LPs) and evaluate its antitumor effect.ARS LPs were prepared by calcium acetate gradient method. The particle size, physical stability,release, pharmacokinetics andantitumor efficacy of the ARS LPs were investigated.The ARS LPs were spherical, the particle size was (134.8 ± 2.654) nm with PDI of 7.8×10-2± 5.1×10-2, the zeta potential was (-19.4 ± 1.57) mV, and the encapsulation efficiency was above 95%. The ARS LPs showed the good stability for 40d at 4 ℃.release experiment indicated that ARS LPs had a sustained release property.pharmacokinetic study revealed that ARS LPs exhibited significantly longer ARS plasma half-life (1/2, 4.6 fold) and higher bioavailability (AUC0-t, 9.2 fold) compared with that of ARS solution. Compared with ARS solution, the ARS LPs could enhance anticancer efficacy with good security.ARS LPs can significantly prolong thehalf-life of artesunate, improve bioavailability, and enhance the anti-tumor effect of artesunate.

pharmaceutics; liposome; calcium acetate gradient; artesunate; pharmacokinetics; antitumor

2019-03-11

蘇玉嬌(1993-), 女(漢族), 遼寧葫蘆島人, 碩士研究生, E-mail 1957588709@qq.com;

王永軍(1977-), 男(漢族), 山東榮成人, 教授, 博士, 博士生導(dǎo)師, 主要從事新型抗癌藥物納米給藥系統(tǒng)及藥物制劑新劑型、新技術(shù)等研究, Tel. 024- 23986325, E-mail i_maple@163.com; 劉凱(1980-), 男(漢族), 山東煙臺人, 博士, 主要從事新藥制劑研發(fā), Tel. 0518-81221551 , E-mail liukai@hrs.com.cn。

R94

A

（2019）05–0169–09

10.14146/j.cnki.cjp.2019.05.003

(本篇責(zé)任編輯：趙桂芝)