黑木耳液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選

于海洋 王延鋒 史磊

摘要為了得到更多的發(fā)酵產(chǎn)物，采用單因素分析和正交實驗，研究黑木耳在發(fā)酵過程中營養(yǎng)成分對菌絲體形態(tài)、生物量及多糖含量的影響。結(jié)果表明，最佳碳源為葡萄糖；最佳氮源為酵母浸膏；添加無機(jī)鹽效果更佳。在以上條件下進(jìn)行黑木耳液體深層發(fā)酵，所獲得的生物量和多糖含量最高。

關(guān)鍵詞黑木耳；發(fā)酵；營養(yǎng)條件；培養(yǎng)基

中圖分類號S646.6文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611（2019）08-0046-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.08.012

AbstractTo get more fermentation products， the single factor analysis and orthogonal test were applied to explore the best conditions for fermentation of black fungus. The effects of nutrient components on mycelium morphology， biomass and polysaccharide contents in the process of Auricularia heimuer fermentation were studied.The results showed that the best carbon source was glucose， the best nitrogen source was yeast extract， and the effect of adding inorganic salt was more obvious. When conductiong deep black fungus fermentation under these conditions， biomass and total income of polysaccharide contents were both the highest.

Key wordsAuricularia heimuer；Fermentation；Nutritional conditions；Culture medium

黑木耳[1]（Auricularia heimuer F，Wu，B.K.Cui &Y.C.Dai）又名木耳、云耳、樹耳、樹蕈、黑耳等，屬擔(dān)子菌綱（Basidiomycetes），主要分布在東亞地區(qū)，我國大多生長在北方，子實體呈褐色，光滑或略有褶皺，通過固體栽培得到的子實體或液體發(fā)酵所獲得的菌絲體中均含有蛋白質(zhì)、多糖等大量活性物質(zhì)，具有增強機(jī)體免疫功能、補血、補腦、抗衰老、抗凝血和抑制腫瘤生長等保健效果和藥用功效[2-3]，也因此獲得“素中之葷”的美譽[4-5]。

筆者利用 100 L生物反應(yīng)器（發(fā)酵罐）進(jìn)行黑木耳液體種深層發(fā)酵培養(yǎng)試驗，選取影響液體發(fā)酵的生長營養(yǎng)因子，研究不同因子對黑木耳液體發(fā)酵培養(yǎng)的菌絲體生物量及胞外粗多糖含量的影響，篩選確定黑木耳液體發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基配方，為黑木耳液體發(fā)酵的研究及液體菌種的應(yīng)用推廣提供理論基礎(chǔ)和實踐依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1供試菌株。黑木耳（Auricularia heimuer）品種為“牡耳2號”，由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院牡丹江分院選育、保藏、提供。

1.1.2試劑。葡萄糖、麥芽糖、瓊脂均購自天津市永大化學(xué)試劑有限公司；可溶性淀粉、硫酸銨、氯化銨、MgSO4·7H2O、蔗糖均購自天津市化學(xué)試劑供銷公司；蛋白胨購自天津市英博生化試劑有限公司；酵母浸膏購自天津市永大化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇、KH2PO4等其他試劑均為分析純；紅糖、馬鈴薯、豆餅粉、麥麩、玉米粉等均購自農(nóng)貿(mào)市場。

1.1.3

儀器。SW-CJ-2F超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；SPX-150BⅢ生化培養(yǎng)箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；YXQ-LS-100A全自動立式電熱壓力蒸汽滅菌器（濟(jì)南來寶醫(yī)療器械有限公司）；YP1201N電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；101A-S型數(shù)顯不銹鋼電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海錦屏儀器儀表有限公司通州分公司）；FSYC-1回旋式振蕩器（大連富森科技有限公司）；FS-100液體菌種培養(yǎng)器（大連富森科技有限公司）；其他試驗設(shè)備為一般常規(guī)儀器。

1.1.4

培養(yǎng)基。PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g（去皮），葡萄糖20 g，瓊脂18 g，水1 000 mL，121 ℃滅菌30 min；種子培養(yǎng)基：葡萄糖2.00%，蔗糖1.00%，蛋白胨0.30%，MgSO4·7H2O 0.05%，KH2PO4 0.05%，維生素B1 微量，121 ℃滅菌30 min；發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖3.00%，蛋白胨0.30%，MgSO4·7H2O 0.05%，KH2PO4 0.05%，維生素B1 微量，121 ℃滅菌30 min。

1.2試驗方法

1.2.1

種子培養(yǎng)。將活化的斜面菌種分割成小塊在無菌條件下接種至種子液培養(yǎng)基中，1 000 mL錐形瓶裝液量為400 mL，25 ℃，160 r/min培養(yǎng)7 d[6]。

1.2.2

液體發(fā)酵培養(yǎng)。將發(fā)酵培養(yǎng)完全的種子液以10%的接種量接種至250 mL的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，錐形瓶裝液量為100 mL，25 ℃，160 r/min培養(yǎng)7 d[7]。

1.2.3

菌絲體的收集。用4層紗布過濾發(fā)酵培養(yǎng)達(dá)到終點的培養(yǎng)液，獲取菌絲體，用蒸餾水重復(fù)清洗菌絲體3次，靜止30 min，105 ℃恒溫干燥箱烘干至恒重，分析天平稱重[8]。

1.2.4

胞外粗多糖的測定。將發(fā)酵液過濾后真空濃縮至原體積的1/5，加入發(fā)酵液3倍體積的無水乙醇后放入4 ℃冰箱靜置24 h取出放置離心機(jī)中4 000 r/min離心5 min得沉淀，將沉淀冷凍干燥得粗多糖，計算胞外粗多糖得率[9]。

1.2.5

發(fā)酵罐培養(yǎng)試驗。菌種于25 ℃條件下火焰法接入發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐培養(yǎng)前空消60 min，實消50 min，100 L發(fā)酵罐裝液量為90 L發(fā)酵培養(yǎng)基，加入0.01% 消泡劑通氣量為0.5～1.0 V/V·min，加熱功率7 850 W，25 ℃條件下無菌培養(yǎng)8 d，對發(fā)酵終點的培養(yǎng)基生物量、粗多糖等測定[10]。

1.2.6正交試驗（培養(yǎng)基配方優(yōu)化試驗）。

以葡萄糖、酵母浸膏、KH2PO4、MgSO4·7H2O 4個因素采用L9（34）設(shè)計進(jìn)行正交試驗[12]。根據(jù)單因素培養(yǎng)規(guī)律，黑木耳粗多糖含量隨著生物量的增加而增大，因此正交試驗以生物量為指標(biāo)對培養(yǎng)基的組成及各組分之間的比例，營養(yǎng)成分進(jìn)行優(yōu)化（表1）。

2結(jié)果與分析

2.1不同碳源對黑木耳液體發(fā)酵菌絲體生物量及胞外粗多糖量的影響由圖1可知，葡萄糖、紅糖、可溶性淀粉、麥芽糖、蔗糖等不同碳源對黑木耳液體發(fā)酵菌絲體生物量和粗多糖含量的影響存在明顯差異，以葡萄糖作為唯一碳源時，黑木耳液體發(fā)酵的生物量和胞外粗多糖量均能達(dá)到最高，其次為蔗糖和麥芽糖，這與前人結(jié)果保持一致[11]。因此，確定葡萄糖為黑木耳液體發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳碳源。

2.2不同氮源對黑木耳液體發(fā)酵菌絲體生物量及胞外粗多糖量的影響

由圖2可知，以3.00%葡萄糖作為碳源，以蛋白胨、酵母浸膏、麩皮、豆餅粉、硫酸銨、氯化銨等為不同氮源對黑木耳液體發(fā)酵菌絲體生物量和胞外粗多糖含量都具有一定的促進(jìn)作用，添加有機(jī)氮源的菌絲球直徑和分散程度明顯優(yōu)于添加無機(jī)氮源。其中，以酵母浸膏作為氮源時，黑木耳菌絲體生物量和胞外粗多糖含量均能夠達(dá)到最高，豆餅粉、蛋白胨作為氮源略低。以硫酸銨、氯化銨作為氮源時的生物量和粗多糖含量明顯最低。

2.3無機(jī)鹽對黑木耳液體發(fā)酵菌絲體生物量及胞外粗多糖量的影響由表2可知，在確定了黑木耳液體發(fā)酵培養(yǎng)的最佳碳源、最佳氮源的條件下，以不添加MgSO4·7H2O和KH2PO4為對照，測定不同含量無機(jī)鹽對黑木耳液體發(fā)酵生物量和胞外粗多糖含量的影響。結(jié)果表明，添加少量無機(jī)鹽能夠促進(jìn)黑木耳液體發(fā)酵菌絲體的生長和胞外粗多糖含量的積累。

2.4正交試驗結(jié)果

由表3可知，極差分析葡萄糖對黑木耳液體發(fā)酵培養(yǎng)的影響最大，其次為硫酸鎂，酵母浸膏對培養(yǎng)基組分的影響最小，多重比較分析得出4、6號處理的液體發(fā)酵培養(yǎng)基配比最合理，并且差異不明顯。但由于酵母浸膏對菌絲體的生長影響最小，因此確定4號處理為最佳配比，最終確定黑木耳培養(yǎng)基的最佳培養(yǎng)基配方為葡萄糖3.00%，酵母浸膏0.20%，MgSO4·7H2O 0.05%，KH2PO4 0.10%，利用黑木耳最佳培養(yǎng)基配方進(jìn)行液體深層發(fā)酵培養(yǎng)，獲得生物量為13.11 g/L，胞外粗多糖含量為7.86 g/L，將發(fā)酵液作為液體菌種接種到三級菌袋中觀察發(fā)現(xiàn)，36 h后菌絲萌發(fā)。

3結(jié)論與討論

黑木耳對碳源的利用率相較于其他因素更為廣泛，單糖、雙糖、多糖均能夠被利用，葡萄糖作為單糖被利用的效果最明顯，生物量和粗多糖含量均能達(dá)到最高，這說明黑木耳在液體發(fā)酵的過程中對小分子單糖、雙糖的利用率高于結(jié)構(gòu)復(fù)雜的多糖；黑木耳在發(fā)酵過程中對有機(jī)氮源的利用率高于單一的無機(jī)氮源，這有可能是因為有機(jī)氮源中含有大量的有機(jī)化合物，水解后更易被吸收，更易合成細(xì)胞中的蛋白質(zhì)和核酸，這與其他食用菌液體發(fā)酵培養(yǎng)的生長規(guī)律一致[13-14]。試驗中酵母浸膏作為氮源的利用率效果最好，其次為豆餅粉、蛋白胨、麩皮。在工業(yè)生產(chǎn)中，考慮到成本等問題，可以選取麩皮、豆餅粉等氮源代替酵母浸膏或按照一定比例添加作為復(fù)合氮源使用；無機(jī)鹽在黑木耳液體發(fā)酵的過程中起到調(diào)節(jié)滲透壓、氧化還原電位等作用，添加少量的無機(jī)鹽能夠促進(jìn)菌絲體和多糖的形成。

食用菌液體發(fā)酵技術(shù)隨著理論基礎(chǔ)和應(yīng)用技術(shù)研究的深入已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，在液體培養(yǎng)過程中能夠產(chǎn)生與子實體相同的生理活性物質(zhì)，與此同時卻能夠縮短生長周期。利用液體發(fā)酵技術(shù)獲得的菌絲體無論是作為菌種進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)還是直接用來制備藥物、保健品等都具有一定的發(fā)展前景。目前，像松茸等一些沒有被馴化的野生菌可以通過液體發(fā)酵的方式獲得菌絲體和代謝產(chǎn)物，以此來彌補因為子實體缺乏而停滯對這些野生菌的開發(fā)利用，黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院牡丹江分院食用菌研究所與牡丹江友邦生物科技股份有限公司正在合作開展相關(guān)研究。因此，液體發(fā)酵技術(shù)今后在醫(yī)療、保健、科研等方面都具有廣闊的應(yīng)用前景和發(fā)展?jié)摿15]。

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