自研利伐沙班片與原研制劑體外溶出行為一致性評(píng)價(jià)

張玉莉，孫宇宏，王曉梅，魏小亮，黨珍，馬超，孫建敏＊

（1.陜西國(guó)際商貿(mào)學(xué)院，陜西咸陽(yáng) 712046；2.陜西步長(zhǎng)高新制藥有限公司，陜西西安 710119）

利伐沙班是一種新型口服抗凝藥物，通過(guò)直接抑制凝血因子X(jué)a來(lái)阻斷內(nèi)源性凝血途徑和終止外源性凝血途徑，從而防止血栓形成。其治療窗寬，用藥后無(wú)需進(jìn)行常規(guī)監(jiān)測(cè)，與食物、藥物相互作用小，因而在血栓防治方面有巨大潛力，臨床上主要用于預(yù)防髖關(guān)節(jié)或膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后，患者深靜脈血栓和肺栓塞的形成[1-7]。該藥物由德國(guó)拜耳公司研發(fā)，商品名為Xarelto?，2008年獲得歐盟許可上市，2009年在中國(guó)批準(zhǔn)進(jìn)口上市，目前國(guó)內(nèi)無(wú)國(guó)產(chǎn)利伐沙班片上市。

利伐沙班為BCS分類Ⅱ類藥物，即低溶解、高滲透藥物，溶出是影響藥物吸收的限速步驟，溶出行為可影響產(chǎn)品的生物利用度。本試驗(yàn)在模擬人體消化道內(nèi)體液的4種基本介質(zhì)中，對(duì)自研制劑進(jìn)行溶出曲線考察，并與原研制劑溶出曲線進(jìn)行比較，采用相似因子法對(duì)其進(jìn)行體外溶出一致性評(píng)價(jià)。

1 儀器與試劑

智能溶出儀（型號(hào)：vision?Elite 8TM，Teledyne Hanson Research）；紫外分光光度儀（型號(hào)：UV-2700，Shimadzu Corporation）；分析天平[型號(hào)：ML204T，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；pH計(jì)（型號(hào)：PB-21，梅特勒-托利多國(guó)際股份有限公司）。

利伐沙班對(duì)照品（15-NOV-17-00，Quality Control Chemicals Inc.，USA）；利伐沙班片原研制劑（商品名：拜瑞妥?，規(guī)格10mg，批號(hào)：BXHEET1，Bayer Pharma AG公司生產(chǎn)）；利伐沙班片自研制劑（規(guī)格：10 mg，批號(hào)17X101，陜西步長(zhǎng)高新制藥有限公司生產(chǎn)）；乙腈為色譜純（Merk公司）；十二烷基硫酸鈉（SDS）、鹽酸、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、醋酸鈉、冰醋酸等均為分析純；水為自制純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶出度測(cè)定方法的建立

參照 FDA 官網(wǎng)“Dissolution Methods”項(xiàng)下利伐沙班片溶出數(shù)據(jù)庫(kù)中的條件和相關(guān)文獻(xiàn)[8-9]，在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上初步建立溶出度測(cè)定方法，具體如下。

2.1.1 對(duì)照品溶液的配制

取利伐沙班對(duì)照品約11 mg，精密稱定，置于100 mL量瓶中，加乙腈50 mL，超聲使溶解，放冷，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL，置50 mL容量瓶中，加溶出介質(zhì)稀釋至刻度，搖勻即得。

2.1.2 操作方法

照《中國(guó)藥典》2015版第四部通則0931溶出度與釋放度測(cè)定法，采用第二法（槳法）裝置，以含0.2%十二烷基硫酸鈉的pH 4.5醋酸鹽緩沖液900 mL為溶劑，轉(zhuǎn)速為 75 r/min，依法操作，30 min取樣，取溶液10 mL，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。照紫外-可見(jiàn)分光光度法（《中國(guó)藥典》2015年版四部通則0401），在250 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定樣品的吸光度，計(jì)算在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的平均累積溶出度。

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 專屬性

參照“2.1.1”項(xiàng)下的方法操作，配制對(duì)照品溶液；取利伐沙班自研制劑適量，研細(xì)，精密稱取適量（約相當(dāng)于利伐沙班11 mg），置于100 mL量瓶中，加乙腈60 mL，超聲處理30 min使利伐沙班溶解，放冷，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液5 mL，置 100 mL量瓶中，加溶出介質(zhì)稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。按處方比例配制空白輔料樣品，并按上述方法制成空白溶液。分別取空白溶液、供試品溶液及對(duì)照品溶液在200～400 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行紫外掃描。結(jié)果表明，對(duì)照品溶液和供試品溶液均在250 nm波長(zhǎng)處有最大的吸收，空白輔料在此處無(wú)吸收，故空白輔料不干擾主成分的測(cè)定，本方法專屬性良好。

2.2.2 儀器精密度

取“2.1.1”試驗(yàn)項(xiàng)下對(duì)照品溶液作為儀器精密度測(cè)定溶液，照紫外-可見(jiàn)分光光度法，在250 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，重復(fù)測(cè)定6次，吸光度RSD為0.11%，儀器精密度良好。

2.2.3 線性關(guān)系

稱取利伐沙班對(duì)照品約11 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加乙腈30 mL，超聲使溶解，放冷，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為儲(chǔ)備液。用溶出介質(zhì)依次稀釋，制成濃度約為 3.4、6.8、9.1、11.4 μg/mL和13.6 μg/mL的溶液，照紫外-可見(jiàn)分光光度法，測(cè)定在250 nm波長(zhǎng)處吸光度。以濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制線性回歸曲線，得線性方程為y=0.05019x+0.00267，r2=1.0000。結(jié)果表明，利伐沙班濃度在3.408～13.632 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取自研制劑，按照“2.2.1”項(xiàng)下的供試品制備方法，平行制備6分樣品，濾過(guò)，在250 nm處檢測(cè)吸光度，記錄測(cè)定結(jié)果，見(jiàn)表1，表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.5 中間精密度試驗(yàn)

取同一批次自研片，不同日期、不同人員使用不同儀器，按“2.4.5重復(fù)性試驗(yàn)”項(xiàng)下操作進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1，表明本方法中間精密度良好。

2.2.6 回收率試驗(yàn)

精密稱定利伐沙班對(duì)照品約11 mg、空白輔料約 8 mg，置于 100 mL 量瓶中，加乙腈 60 mL 超聲溶解，放冷，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，分別精密量取 3 mL、4 mL、5 mL，置 50 mL 量瓶中，加溶出介質(zhì)稀釋至刻度，搖勻，制成相當(dāng)于利伐沙班溶出度達(dá)60%、80%、100%的系列溶液，每個(gè)濃度同法配制3份。照“2.1.3”項(xiàng)下方法，在250 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，結(jié)果見(jiàn)表2。3個(gè)濃度共9份樣品中利伐沙班的回收率均大于99%，RSD均在2%以內(nèi)，表明該測(cè)定方法的準(zhǔn)確度良好。

表1 重復(fù)性、中間精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2.7 溶液穩(wěn)定性

照“2.2.1”項(xiàng)下配制對(duì)照品溶液及供試品溶液，在室溫下放置，分別于 0、2、4、8、12h在250 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。結(jié)果利伐沙班對(duì)照品及供試品吸光度無(wú)明顯變化，RSD均小于2%，溶液穩(wěn)定。

2.2.8 濾膜吸附試驗(yàn)

取利伐沙班片1片至1 000 mL量瓶中，加900 mL的溶出介質(zhì)，超聲處理30 min，放冷至室溫，搖勻，過(guò)濾，濾液用聚醚砜0.45 μm濾膜過(guò)濾，分別棄去0 mL、1 mL、3 mL、5 mL、7 mL、10 mL 初濾液后，作為濾膜吸附考察用溶液，取各溶液分別在250 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，記錄結(jié)果，結(jié)果見(jiàn)表3，表明濾膜對(duì)樣品無(wú)吸附。

2.3 溶出曲線的測(cè)定與評(píng)價(jià)

2.3.1 溶出介質(zhì)的配制

含0.2%十二烷基硫酸鈉（SDS）的pH4.5醋酸鹽緩沖液：取 2.99 g醋酸鈉，置于 1 000 mL 水中，加1.66 mL冰醋酸和20 mL的10%SDS溶液，用氫氧化鈉試液或冰醋酸調(diào)節(jié)pH至4.50±0.1。

表3 濾膜吸附試驗(yàn)結(jié)果

pH 4.5醋酸鹽緩沖液：取2.99 g醋酸鈉，置于 1 000 mL水中，再加入 2 mol/mL醋酸溶液 1 4 mL，搖勻，即得，用氫氧化鈉試液或冰醋酸調(diào)節(jié)pH至4.50±0.1。

0.1 mol/mL 鹽 酸溶液：取濃鹽酸溶液 9 mL，加水稀釋至 1 000 mL，搖勻，即得。

pH 6.8磷酸鹽緩沖液：將0.2 mol/mL磷酸二氫鉀溶液 2 50 mL 與 0.2 mol/mL 氫 氧化鈉溶液 1 12.0 mL 溶液混合，加水稀釋至1 000 mL，用氫氧化鈉試液或冰醋酸調(diào)節(jié)pH至6.8±0.1。

2.3.2 不同溶出介質(zhì)的溶液穩(wěn)定性考察

按“2.2.1”項(xiàng)下配制供試品溶液，分別用溶出介質(zhì) pH 4.5+0.2% SDS醋酸鹽緩沖液、pH 4.5醋酸鹽緩沖液、0.1 mol/mL鹽酸溶液、pH 6.8磷酸鹽緩沖液稀釋至100 mL，各供試品溶液在室溫放置0、2、4、8 h 和 12 h，在 250 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，考察不同溶出介質(zhì)中的溶液穩(wěn)定性，見(jiàn)表4。結(jié)果表明利伐沙班分別在4種溶出介質(zhì)中，溶液于室溫放置12 h內(nèi)較穩(wěn)定。取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液作為儀器精密度測(cè)定溶液，照紫外-可見(jiàn)分光光度法，在250 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，重復(fù)測(cè)定6次，吸光度RSD均小于0.5%，儀器精密度良好。

表4 不同溶出介質(zhì)中溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.3.3 不同介質(zhì)溶出曲線的測(cè)定

取本品自研制劑及原研制劑各12片，以pH 4.5+0.2% SDS醋酸鹽緩沖液、pH4.5醋酸鹽緩沖液、0.1 mol/mL鹽酸溶液、pH 6.8磷酸鹽緩沖液各900 mL為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速為75 r/min，分別于規(guī)定的不同時(shí)間點(diǎn)，取溶出液10 mL，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液，溶出杯中及時(shí)補(bǔ)充10 mL測(cè)定溫度的溶出介質(zhì)；對(duì)照品溶液配制參照“2.1.1”項(xiàng)下。取上述各溶液，照紫外-可見(jiàn)分光光度法（《中國(guó)藥典》2015年版四部通則0931第二法），于250 nm的波長(zhǎng)處分別測(cè)定吸光度，計(jì)算每片的溶出度，繪制溶出曲線，見(jiàn)圖1，f2因子匯總見(jiàn)表5。其中在pH 4.5+0.2% SDS醋酸鹽緩沖液中，15 min內(nèi)自研制劑和原研制劑累積溶出量均達(dá)到85%以上，可認(rèn)為相似；在其余3種不同溶出介質(zhì)中，自研制劑與原研制劑的溶出行為也相似，具有一致性（f2因子均＞50%）。

圖1 自研制劑與原研制劑在不同溶出介質(zhì)中的溶出曲線（n=12）

表5 不同介質(zhì)中的f2因子（n=12）

2.3.4 不同轉(zhuǎn)速條件

取自研制劑與原研制劑各12片，用pH 4.5+0.2%SDS醋酸鹽緩沖液作溶出介質(zhì)，參照“2.1.2”，分別采用50、75 r/min不同轉(zhuǎn)速測(cè)定兩者的溶出曲線，在 0、10、15、30、45 min 和 60 min 分別取 樣，并采用相似性f2因子法評(píng)價(jià)，結(jié)果見(jiàn)表6，表明本品自研制劑和參比制劑的溶出行為均相似（f2因子均＞50%），轉(zhuǎn)速為 50 r/min時(shí)，15 min時(shí)累積溶出度不到80%，30 min時(shí)累積溶出度不足85%，低于75 r/min 時(shí) 15 min、30 min 的累積溶出量。

表6 不同轉(zhuǎn)速的溶出曲線對(duì)比（n=12）

3 結(jié)論

本試驗(yàn)建立紫外-可見(jiàn)分光光度法檢測(cè)利伐沙班片溶出度方法，該方法經(jīng)驗(yàn)證，專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確度高，操作簡(jiǎn)單，可作為體外一致性評(píng)價(jià)的重要檢測(cè)方法。

根據(jù)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布的《普通口服固體制劑溶出曲線測(cè)定與比較指導(dǎo)原則》，通過(guò)比較自研制劑與原研制劑體外多條溶出曲線相似性的方法，評(píng)價(jià)仿制制劑的質(zhì)量一致性。利伐沙班生物藥劑學(xué)分類屬于2類，其生物利用度與溶出過(guò)程密切相關(guān)。溶出度研究在口服固體制劑的開(kāi)發(fā)評(píng)價(jià)中起著關(guān)鍵性作用。本試驗(yàn)根據(jù)利伐沙班片的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，顯示出利伐沙班在胃中釋放、在小腸吸收，生物利用度較高，因此模擬體內(nèi)的環(huán)境，確定溶出介質(zhì)為pH 4.5+0.2% SDS、pH 4.5醋酸鹽緩沖液、0.1 mol/mL鹽酸溶液、pH 6.8磷酸鹽緩沖液，經(jīng)對(duì)比研究，自研制劑與原研制劑4條溶出曲線均相似，進(jìn)一步考察不同轉(zhuǎn)速下，2種制劑的溶出曲線，也顯示出一致性，同時(shí)表明本品對(duì)轉(zhuǎn)速的改變較敏感。本試驗(yàn)為本品的生物等效性試驗(yàn)提供了依據(jù)，極大地減少BE的風(fēng)險(xiǎn)。