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    紅景天提取物體外抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用機(jī)制研究

    2015-06-09 19:20:19王媛媛
    天津藥學(xué) 2015年6期
    關(guān)鍵詞:紅景天抑制率培養(yǎng)液

    王媛媛,林 宏

    (天津市兒童醫(yī)院,天津 300074)

    ?

    實(shí)驗(yàn)研究

    紅景天提取物體外抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用機(jī)制研究

    王媛媛,林 宏*

    (天津市兒童醫(yī)院,天津 300074)

    目的:研究紅景天提取物體外抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用機(jī)制。方法:采用MTT、劃痕實(shí)驗(yàn)、matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)、血管生成實(shí)驗(yàn)及Western blot蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)紅景天提取物不同濃度對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的細(xì)胞毒作用、侵襲能力、遷移能力和血管生成能力的影響。結(jié)果:紅景天提取物40 mg/ml對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231及HUVEC均無毒性,在不同濃度下均能抑制人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的侵襲、遷移能力及HUVEC血管生成能力,并能顯著性抑制PI3K/Akt信號(hào)通路Akt及PKCζ蛋白磷酸化水平。結(jié)論:紅景天提取物能夠從抑制腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移及血管生成多方面發(fā)揮抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用,并通過抑制PI3K/Akt信號(hào)通路抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

    紅景天提取物,乳腺癌細(xì)胞,人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,抗腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移,血管生成

    紅景天為景天科景天屬(RhodiolaroseaL)多年生草本或亞灌木珍稀野生植物,多生長(zhǎng)在海拔3 500~5 000 m的高山流石或灌木叢中[1,2]。研究結(jié)果顯示,紅景天中含有多種化合物,其中紅景天苷是迄今研究最多的有效活性成分,已被廣泛用于預(yù)防高原病、抗衰老、抗抑郁、抗腫瘤及消除疲勞等方面。已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,紅景天苷可以抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖[3]。但目前關(guān)于紅景天對(duì)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制研究較少。本文以人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞為研究對(duì)象,對(duì)紅景天提取物體外抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用機(jī)制進(jìn)行探討。

    1 實(shí)驗(yàn)材料

    1.1 細(xì)胞 人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫);人臍靜脈上皮細(xì)胞(百奧邁科生物技術(shù)有限公司)。

    1.2 試劑與藥品 狹葉紅景天(四川艾麗碧絲制藥有限公司);RPMI1640培養(yǎng)液 (HyClone);胎牛血清(Bioind);PBS(HyClone);四甲基偶氮唑鹽(MTT)(Sigma);(含25%EDTA)胰蛋白酶(Bioind);基底膠matrigel(Invitrogen);HUVEC培養(yǎng)液(百奧邁科生物技術(shù)有限公司)。

    1.3 儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱(Heal Force公司);超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司);全自動(dòng)酶標(biāo)板分析儀(BIO-RAD公司);倒置顯微鏡 (Olympus公司);電泳儀(美國伯樂公司);Transwell小室(Corning);培養(yǎng)皿、96孔酶標(biāo)板、6孔板(Nest)。

    2 實(shí)驗(yàn)方法

    2.1 紅景天提取物的制備 取20 g狹葉紅景天,用粉碎機(jī)粉碎后置于圓底燒瓶中,加入10倍體積的95%乙醇,80 ℃水浴加熱回流1 h,用紗布過濾提取液。殘?jiān)性偌尤?倍體積的75%乙醇,80 ℃水浴加熱回流1 h,用紗布過濾提取液。殘?jiān)性偌尤?倍體積的50%乙醇,80 ℃水浴加熱回流1 h,用紗布過濾提取液。殘?jiān)凶詈蠹尤?倍量水,80 ℃水浴加熱回流1 h,用紗布過濾提取液。將四次提取液混合,減壓濃縮,65 ℃真空干燥箱內(nèi)真空干燥過夜,得到6 g干粉樣提取物,經(jīng)檢測(cè),每1 mg干粉含紅景天苷16.0 μg。使用時(shí)紅景天提取物用二甲基亞砜(DMSO)溶解成高濃度儲(chǔ)備液,再用培養(yǎng)液稀釋成相應(yīng)濃度作用于細(xì)胞,其DMSO含量小于0.1%。以此制得高、中、低三個(gè)濃度分別為10、20和40 mg/ml的紅景天提取物溶液。

    2.2 細(xì)胞培養(yǎng) MDA-MB-231細(xì)胞和HUVEC分別用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液和含10%血清的HUVEC專用培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng),將培養(yǎng)皿置于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng),待其長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿底時(shí),棄去培養(yǎng)液,加入胰蛋白酶消化液約2 ml,顯微鏡下觀察,待細(xì)胞質(zhì)回縮,細(xì)胞間隙增大,終止消化,小心去除消化液,加入6 ml培養(yǎng)液反復(fù)吹打,使細(xì)胞從皿底脫落后,形成細(xì)胞懸液,鏡下觀察細(xì)胞。等份分裝3~4皿,繼續(xù)放于37 ℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)。

    2.3 MTT細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞用0.25%胰酶消化,吸出胰酶后,用含10%FBS的培養(yǎng)液終止消化,混勻細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù),調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1×104個(gè)/ml。將調(diào)好的細(xì)胞懸液加于96孔板,每孔180 μl,置于37 ℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)24 h,24 h后加藥,每個(gè)濃度5個(gè)復(fù)孔,繼續(xù)置于37 ℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)48 h。之后每孔加5 mg/ml的MTT 15 μl,37 ℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)4 h,4 h后取出96板,將上清液吸出,每孔加100 μl的DMSO,用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度。抑制率 (%) =[1-(加藥組OD值/空白組OD值)]×100%。

    2.4 劃痕實(shí)驗(yàn) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,均勻接種于六孔板中;待細(xì)胞長(zhǎng)至完全融合后,用10 μl無菌槍頭在每孔單層細(xì)胞中央輕輕地劃一道傷痕,沿劃痕邊緣等距離間隔做上標(biāo)記,以便檢測(cè);PBS沖洗,換液后分別用不同濃度的化合物處理24 h;然后用倒置顯微鏡觀察劃痕愈合程度并拍照,利用IPPWIN60統(tǒng)計(jì)劃痕距離,然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,抑制率 (%) =[1-(空白組0 h距離-加藥組24 h距離)/(空白組0 h距離-空白組24 h距離)]×100%。

    2.5 Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)開始前6 h,將matrigel用PBS稀釋8倍后加入到Transwell小室的上室,50 μl/小室,置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)6 h,讓matrigel凝固,6 h后將加藥處理24 h的細(xì)胞消化后離心棄去培養(yǎng)液,用無血清培養(yǎng)基重懸,調(diào)整細(xì)胞密度至5×105個(gè)/ml;取細(xì)胞懸液100 μl加入Transwell小室的上室,下室一般加入650 μl含10% FBS的培養(yǎng)基,同時(shí)上下室各加入終濃度相同的待處理化合物;37 ℃、5%CO2培養(yǎng) 18 h后,棄去上室液體,用棉簽擦去膜上未遷移的細(xì)胞和matrigel;用PBS洗2遍,90%乙醇固定30 min,0.5%曙紅染色20 min后,倒置顯微鏡下直接觀察穿過膜的細(xì)胞;每張膜中央部分和周圍部分各隨機(jī)取3個(gè)視野,計(jì)數(shù)每個(gè)視野內(nèi)的穿過8 μm微孔的細(xì)胞數(shù),抑制率 (%) =[1-(加藥組細(xì)胞數(shù)/空白組細(xì)胞數(shù))]×100%。

    2.6 血管生成實(shí)驗(yàn) 血管生成實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[4],稍有改進(jìn)。matrigel膠于4 ℃過夜融化,同時(shí)將槍頭和96孔板于-20 ℃預(yù)冷備用;實(shí)驗(yàn)時(shí)將預(yù)冷的96孔板置于冰上,用預(yù)冷的槍頭吸取matrigel膠50 μl/well加入到孔中并避免氣泡形成,然后將96孔板放入37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱,放置1 h使膠凝固;已用不同濃度化合物共培養(yǎng)24 h的HUVEC細(xì)胞,用胰酶消化,計(jì)數(shù)并稀釋,將密度為1×105個(gè)/ml的細(xì)胞100 μl/well接種于預(yù)先鋪好的matrigel上,繼續(xù)培養(yǎng)12 h;倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的變化并拍照記錄小管形成情況,每孔隨機(jī)攝取3個(gè)視野,整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

    2.7 蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn) 加藥處理24 h的細(xì)胞加裂解液裂解后,12 000 r/min離心20 min,取上清,加入5×蛋白上樣緩沖液95 ℃沸煮5 min后在10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠中電泳,電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上,然后用5%的脫脂牛奶封閉1 h,洗膜后分別加入Akt、PKCζ和β-actin的抗體,濃度為1∶1 000稀釋,4 ℃過夜。再次洗膜后加入第二抗體進(jìn)行反應(yīng),室溫孵育1 h,洗膜后ECL熒光顯色和曝光。利用圖像分析系統(tǒng)確定X線光膠片上蛋白條帶的相對(duì)灰度。

    3 結(jié)果

    3.1 紅景天提取物對(duì)細(xì)胞的毒性作用 本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了紅景天提取物低、中、高三個(gè)濃度(10、20和40 mg/ml)對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和人HUVEC細(xì)胞的毒性,提取物與細(xì)胞共孵育24 h后采用MTT比色法檢測(cè)提取物各濃度下對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用,用吸光度值(OD值)按照抑制率計(jì)算公式計(jì)算抑制率,結(jié)果見表1,紅景天提取物各濃度對(duì)兩種細(xì)胞系均未顯示出顯著的細(xì)胞毒性作用。

    3.2 紅景天提取物對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力的影響 劃痕實(shí)驗(yàn)(又稱傷口愈合實(shí)驗(yàn))是檢測(cè)細(xì)胞遷移能力的一種方法。在沒有誘導(dǎo)因子的情況下,細(xì)胞可以感受到“傷口”,并通過重組微管組織中心沿垂直于傷口劃痕的方向運(yùn)動(dòng)。

    本實(shí)驗(yàn)采用該方法為評(píng)價(jià)手段,測(cè)定紅景天提取物在非細(xì)胞毒劑量下對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力的影響。待細(xì)胞單層貼壁后用槍頭均勻的劃出一道傷痕,同時(shí)給予各濃度紅景天提取物與細(xì)胞共培養(yǎng),24 h后觀察傷痕愈合情況,用微鏡測(cè)微尺測(cè)量?jī)商巶蹖挾?,見圖1,各給藥組的傷痕寬度均比空白組寬,且具有顯著性差異(P<0.01)。此外,三個(gè)劑量組分別與空白組比較,計(jì)算紅景天提取物對(duì)MDA-MB-231遷移能力的抑制率,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。紅景天提取物各濃度組劑量依賴性抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移,其40 mg/ml濃度下的抑制率為93.75%,顯示出極強(qiáng)的抑制作用。

    表1 紅景天提取物對(duì)MDAMB231和HUVEC的細(xì)胞毒性

    圖1 紅景天提取物對(duì)MDA-MB-231遷移能力的影響

    圖2 紅景天提取物對(duì)MDA-MB-231遷移能力的抑制率

    3.3 紅景天提取物對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力的影響 人工重構(gòu)基底膜材料Matrigel,是一種細(xì)胞外基質(zhì),主要成分為層黏連蛋白和Ⅳ型膠原,能在培養(yǎng)基中重建形成膜結(jié)構(gòu),這種膜結(jié)構(gòu)與天然基質(zhì)膜結(jié)構(gòu)極為相似,當(dāng)Transwell小室上室濾膜被Matrigel覆蓋,細(xì)胞不能自由穿過,必須分泌水解酶,并通過變形運(yùn)動(dòng)才能穿過這種鋪有Martrigel的濾膜,這與體內(nèi)情況較為相似,見圖3。利用該實(shí)驗(yàn)觀察紅景天提取物對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231侵襲能力的影響,計(jì)數(shù)給藥孵育24 h的細(xì)胞穿過Matrigel的數(shù)量,各給藥組的細(xì)胞數(shù)與空白組比較均有顯著性差異(P<0.01)。抑制率結(jié)果顯示紅景天提取物對(duì)乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力具有顯著的抑制作用,并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性,見圖4。

    圖3 紅景天提取物對(duì)MDA-MB-231侵襲能力的影響

    圖4 紅景天提取物對(duì)MDA-MB-231侵襲能力的抑制率

    3.4 紅景天提取物對(duì)HUVEC細(xì)胞血管生成能力的影響 腫瘤的血管生成是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過程,包括內(nèi)皮細(xì)胞釋放蛋白酶、基底膜降解、內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖和內(nèi)皮細(xì)胞形成管腔。腫瘤的生長(zhǎng)是血管依賴性的,因而血管化的腫瘤生長(zhǎng)速度加快且易發(fā)生轉(zhuǎn)移。因此通過抑制新生血管的形成來治療腫瘤,已經(jīng)成為腫瘤治療的新策略。本試驗(yàn)利用人HUVEC體外血管生成實(shí)驗(yàn)?zāi)M體內(nèi)的血管生成。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,紅景天提取物能夠有效地抑制HUVEC血管生成的能力,并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性,在高濃度作用下已經(jīng)完全抑制了HUVEC細(xì)胞小管的形成,見圖5。

    圖5 紅景天提取物對(duì)HUVEC血管生成的抑制作用

    3.5 紅景天提取物對(duì)相關(guān)蛋白磷酸化的影響 基于以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果,本文進(jìn)一步就紅景天提取物對(duì)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移抑制作用機(jī)制進(jìn)行了研究,利用蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了紅景天提取物對(duì)與腫瘤細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白硫酸化水平的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,紅景天提取物能夠有效地抑制MDA-MB-231細(xì)胞的Akt及PKCζ的磷酸化水平,并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性,見圖6。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為3次平行實(shí)驗(yàn)的均值。以誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)差,低、中、高劑量組與空白組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,分別為P<0.05、P<0.01和P<0.001。

    圖6 紅景天提取物對(duì)Akt、PKCζ蛋白磷酸化水平的影響

    4 討論

    紅景天在民間被稱為“黃金根”,顯示出其重要的藥用價(jià)值。我國紅景天資源豐富,分布廣泛,作為藥用植物入藥應(yīng)用歷史悠久。近代藥理學(xué)研究顯示,其不僅在體外有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用,如Hela細(xì)胞[5]、肝癌QGY-7703細(xì)胞[6]、肺腺癌細(xì)胞SPC-A-1[7],而且在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中也顯示出很好的抑瘤作用。實(shí)驗(yàn)研究顯示,不同劑量的紅景天苷能夠劑量依賴性抑制人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的c-myc表達(dá),降低肝癌的惡性程度[8]。體內(nèi)藥理實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),紅景天提取物能夠抑制裸鼠乳腺癌移植瘤的VEGF蛋白表達(dá),提示其在體內(nèi)可能具有抑制腫瘤血管生成的作用[9];此外體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察紅景天提取物經(jīng)灌胃給藥處理對(duì)荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的作用,結(jié)果顯示紅景天組的抑瘤率達(dá)到了70.9%,顯示出極好的腫瘤抑制作用[10]。

    紅景天臨床應(yīng)用上主要集中在心腦血管疾病方面,其抗腫瘤作用實(shí)驗(yàn)報(bào)道較多,但其臨床應(yīng)用報(bào)道少見,目前仍處于輔助用藥的地位。雖然紅景天抗腫瘤作用的報(bào)道較多,但多為宏觀效果的報(bào)道,其具體的抗腫瘤作用機(jī)制研究較少,本實(shí)驗(yàn)著重對(duì)紅景天提取物對(duì)抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移方面做了深入探討,就腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲及血管生成三個(gè)方面,從腫瘤轉(zhuǎn)移必經(jīng)的幾個(gè)階段對(duì)其進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,紅景天提取物在無細(xì)胞劑量下劑量依賴性抑制腫瘤細(xì)胞MDA-MB-231的遷移、侵襲及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC的血管生成,進(jìn)一步機(jī)制研究顯示,紅景天提取物能夠劑量依賴地抑制腫瘤轉(zhuǎn)移重要信號(hào)通路PI3K/Akt的蛋白磷酸化,顯示出顯著的抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用。

    腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要特征,是引起惡性腫瘤患者死亡的首要因素,如果能有效地抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移,就能顯著地降低腫瘤的致死率。因此,抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移藥物的研究也成了近年研究熱點(diǎn),本實(shí)驗(yàn)對(duì)紅景天提取物抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制進(jìn)行了探討,將為其應(yīng)用與臨床治療腫瘤提供堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù),使其更好地應(yīng)用于臨床。

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    Mechanism of anti-tumor metastasis forRhodiolaextraction in vitro

    Wang Yuanyuan,Lin Hong

    (Tianjin Children′s Hosptial, Tianjin 300074)

    Objective:To study the mechanism of anti-tumor metastasis forRhodiolaextraction in vitro. Methods:The effects ofRhodiolaextraction on cytotoxicity, cell migration, invasion, tube formation and the phosphorylation of protein of human breast cancer cell(MDA-MB-231) and human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) were measured by MTT assay, wound healing assay, invasion assay, tube formation assay and western blot assay, respectively. Results:Rhodiolaextraction exhibited no cytotoxicity for MDA-MB-231 and HUVEC cells at 40 mg/ml, and inhibited cell migration, invasion and tube formation with various concentrations. Furthermore,Rhodiolaextraction also decreased phosphorylation of Akt and PKCζ on PI3K/Akt signaling pathway significantly. Conclusion:Rhodiolaextraction can suppress anti-tumor metastasis by inhibiting cancer cell migration, invasion, tube formation, and the PI3k/Akt signaling pathway.

    Rhodiolaextraction, breast cancer cell,HUVEC,anti-tumor metastasis, tube formation

    2015-09-17

    R979.1

    A

    1006-5687(2015)06-0001-05

    *通訊作者:林宏,E-mail:jane1523@163.com。

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