含Ⅰ型血小板結(jié)合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶10在壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚中的表達(dá)及其與心肌纖維化的關(guān)系

王震，王夢龍，劉劍芳，葉晶，徐瑤，姜慧敏，葉迪，張記收，萬軍

心肌肥厚是心臟應(yīng)對機(jī)械及神經(jīng)體液等多種刺激產(chǎn)生的適應(yīng)性改變，是高血壓、心臟瓣膜病、心肌梗死及先天性心臟病等多種心血管病的共同病理生理過程，其主要病理變化包括心肌細(xì)胞體積增大、細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）合成增多和膠原沉積等[1-2]。含Ⅰ型血小板結(jié)合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶（ADAMTS）家族是一類新型的分泌型金屬蛋白酶，參與血管形成、排卵、炎癥反應(yīng)和止血等生理過程。多項研究表明，ADAMTS家族參與調(diào)控多種心血管病，包括動脈粥硬化、心肌梗死、心臟瓣膜病和心力衰竭等[3-4]。本研究擬通過主動脈弓縮窄術(shù)（TAC）建立小鼠心肌肥厚模型，探討ADAMTS10在心肌重構(gòu)病理生理過程中的作用，為防治心肌肥厚及纖維化提供理論依據(jù)和治療的新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

實(shí)驗材料: SPF級C57BL/6J雄性小鼠60只，8～10周齡，體質(zhì)量（25.0±2.0）g，由武漢大學(xué)心血管病研究所提供，許可證號：SYXK（鄂）2009-0053。飼養(yǎng)在武漢大學(xué)心血管病研究所動物房小鼠微屏障飼養(yǎng)系統(tǒng)，給予充足的喂食和水，待小鼠適應(yīng)環(huán)境后，利用計算機(jī)生成隨機(jī)數(shù)字表，采用隨機(jī)數(shù)字法隨機(jī)分為假手術(shù)組（n=20）和實(shí)驗組（n=40）。

試劑和儀器：主要試劑：二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒（Thermo Fisher公司，美國）；ADAMTS10（ab173290）、波 形 蛋 白（Vimentin，ab92547）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH, ab8245）抗體均購自Abcam公司（英國）；二抗（LI-COR公司，美國）；TRIzol試劑和反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Roche公司，瑞士），其余試劑為國產(chǎn)分析純。主要的實(shí)驗儀器有：超聲裂解儀、研磨儀、包埋機(jī)、超高速離心機(jī)、分光光度計、酶標(biāo)儀、烤箱、水浴鍋、脫水機(jī)、病理切片機(jī)、蛋白/核酸電泳儀、轉(zhuǎn)膜槽、搖床、封膜機(jī)、雙色紅外熒光成像系統(tǒng)、倒置熒光顯微鏡、實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測儀、MyLab30CV型超聲儀（Biosound Esaote公司，意大利）。

心肌肥厚模型的建立：由本實(shí)驗室專職工作人員負(fù)責(zé)造模，操作步驟如下：（1）實(shí)驗組小鼠的制備：3%戊巴比妥鈉溶液（30 mg/kg）腹腔注射麻醉小鼠后，備皮，將小鼠仰臥位固定在操作臺上，套管針氣管插管后用小動物呼吸機(jī)輔助呼吸。在胸骨左緣2～3肋間做一橫行切口，依次分離皮膚、肌肉及軟組織，打開胸腔，用顯微鑷游離主動脈弓。將7-0結(jié)扎線穿過主動脈弓，同時平行主動脈弓放置一去尖的26/27 G針頭，將主動脈弓與針頭一起結(jié)扎，然后迅速抽出針頭，逐層關(guān)胸。（2）假手術(shù)組小鼠：只穿線，不結(jié)扎，其余步驟同前。

檢測心功能和血壓：分別于術(shù)后4周和8周檢測小鼠心臟功能。1.5%異氟烷吸入麻醉小鼠，備皮，涂抹耦合劑，仰臥位對小鼠行心臟超聲檢查，探頭頻率10 MHz。選取標(biāo)準(zhǔn)左心室乳頭肌短軸切面，測量并記錄左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）和左心室短軸縮短率（LVFS）。

組織病理學(xué)檢測：稱量并記錄小鼠體質(zhì)量，其中實(shí)驗組小鼠于第4周和第8周處死，取出心臟，放入10% KCl溶液中洗掉血液，稱量并記錄小鼠心臟質(zhì)量。將心尖部分迅速放入液氮中保存，之后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。其余左心室組織進(jìn)行多聚甲醛固定、脫水、石蠟包埋、切片。切片進(jìn)行蘇木素-伊紅染色法（HE）、天狼猩紅和麥芽胚凝集素染色（WGA），顯微鏡下觀察并拍片，使用image pro plus 6.0軟件計算心肌細(xì)胞橫截面積和左心室膠原分?jǐn)?shù)。

免疫熒光檢測：切片進(jìn)行抗原修復(fù)后，磷酸鹽緩沖液漂洗3次，之后用2%小牛血清白蛋白封閉30 min。輕輕甩掉封閉液，在切片上分別滴加適當(dāng)?shù)目贵w，平放于濕盒內(nèi)4℃孵育過夜。切片洗滌3次后二抗孵育10 min，隨后4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染液復(fù)染細(xì)胞核。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

心肌組織信使RNA（mRNA）表達(dá)的檢測：于-80℃冰箱取出樣本，TRIzol法提取總RNA，分光光度計測定RNA濃度，計算RNA提取量，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。構(gòu)建PCR反應(yīng)體系，利用羅氏Lightcycler480 Real-time PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性10 s、60℃退火10 s、72℃延伸20 s，共40個循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參，采用2-△△Ct法對結(jié)果進(jìn)行定量分析。利用Primer-BLAST在線設(shè)計引物，特異度引物序列由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成，特異性引物序列見表1。

表1 特異度引物序列

心肌組織蛋白表達(dá)水平檢測：取適量心肌組織，按10 mg/100 μl反應(yīng)體系加入裂解液，提取蛋白，BCA法進(jìn)行定量。制備十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠，按40 μg/孔道上樣電泳，待電泳結(jié)束后取出凝膠，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶封閉1 h，加入適量一抗（anti-ADAMTS 10，1:1 000稀釋）4℃孵育過夜，隨后二抗孵育1 h，雙色紅外熒光成像系統(tǒng)掃膜，以GAPDH為內(nèi)參分析和計算相關(guān)蛋白表達(dá)水平。

統(tǒng)計學(xué)方法: 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩變量間相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

兩組小鼠心功能比較（表2）：假手術(shù)組2只小鼠出現(xiàn)麻醉意外，實(shí)驗組4周和8周各有2只不符合心肌肥厚標(biāo)準(zhǔn)，剔除出實(shí)驗組。實(shí)驗組與假手術(shù)組相比， 4周小鼠心臟質(zhì)量明顯增加（P＜0.05），且在實(shí)驗組第8周進(jìn)一步升高（P＜0.05）；超聲結(jié)果表明，與假手術(shù)組比較， 實(shí)驗組4周小鼠LVEF和LVFS均顯著降低（P＜0.05），且在實(shí)驗組8周進(jìn)一步降低（P＜0.05）。

表2 兩組小鼠心功能比較（

表2 兩組小鼠心功能比較（

注： BW：體質(zhì)量；HW：心臟質(zhì)量； LVEF：左心室射血分?jǐn)?shù)；LVFS：左心室短軸收縮率。與假手術(shù)組比較aP＜0.05；與實(shí)驗組4周相比bP＜0.05

項目 假手術(shù)組(n=18) 實(shí)驗組4周(n=18) 8周(n=18)BW (g) 27.6±2.4 26.6±1.7 27.3±2.9 HW (mg) 120.1±9.6 156.1±11.3a 187.9±10.6b LVEF (%) 79.6±4.1 62.2±3.5a 50.4±4.3b LVFS (%) 41.2±2.3 33.6±3.1a 28.5±3.2b

兩組大鼠心肌組織ADAMTS10 mRNA和蛋白表達(dá)的比較（圖1、圖2）：與假手術(shù)組相比， 實(shí)驗組4周小鼠心肌組織ADAMTS10 mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）；實(shí)驗組8周與實(shí)驗組4周小鼠比較， 8周小鼠的心肌組織ADAMTS10 mRNA和蛋白表達(dá)又進(jìn)一步上調(diào)（P＜0.05）。

ADAMTS10在心肌組織中定位（圖3）：免疫熒光染色結(jié)果提示：ADAMTS10與心肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物波形蛋白（Vimentin）共表達(dá)，ADAMTS10定位于心肌成纖維細(xì)胞。

圖1 兩組小鼠心臟組織中ADAMTS10 mRNA表達(dá)情況（n=18）

圖2 兩組小鼠心臟組織中ADAMTS10蛋白表達(dá)情況（n=18）

圖3 ADAMTS10在小鼠心肌組織中的定位

心肌組織ADAMTS10與心肌肥厚的相關(guān)性分析：病理染色顯示，實(shí)驗組與假手術(shù)組相比，心肌細(xì)胞橫截面積增大，且相較于實(shí)驗組4周，實(shí)驗組8周小鼠心肌細(xì)胞橫截面積進(jìn)一步增大，心肌肥厚程度進(jìn)一步加重（P＜0.05，圖4）。實(shí)驗組4周與8周小鼠心肌組織ADAMTS10 mRNA水平與心房鈉尿肽（ANP）、β-心肌肌球蛋白重鏈（β-MHC）的mRNA水平呈正相關(guān)（P＜0.05，圖5）。

圖4 小鼠心臟組織HE和WGA染色結(jié)果（X400）及心肌細(xì)胞橫截面積

圖5 實(shí)驗組小鼠心臟組織中ADAMTS10 mRNA與ANP mRNA和β-MHC mRNA水平的相關(guān)性分析（n=18）

心肌組織ADAMTS10與心肌纖維化相關(guān)性分析:天狼猩紅染色顯示，實(shí)驗組小鼠心肌膠原增加，且相較于實(shí)驗組4周，實(shí)驗組8周小鼠心肌膠原進(jìn)一步增加，纖維化程度進(jìn)一步加重（P＜0.05，圖6）。實(shí)驗組 4周和8周小鼠心肌組織ADAMTS10 mRNA水平與MMP2、MMP9的mRNA水平呈正相關(guān)（P均＜0.05，圖7）。

圖6 小鼠心臟組織天狼猩紅染色結(jié)果（X400）

圖7 實(shí)驗組小鼠心臟組織中ADAMTS10 mRNA與MMP2 mRNA和MMP9 mRNA水平的相關(guān)性分析(n=18)

3 討論

心肌肥厚是心臟應(yīng)對各種損傷時產(chǎn)生的一種代償機(jī)制。在組織器官水平表現(xiàn)為室壁增厚、室壁順應(yīng)性下降；細(xì)胞水平表現(xiàn)為心肌細(xì)胞肥大，基質(zhì)細(xì)胞增殖導(dǎo)致大量膠原沉積；分子水平表現(xiàn)為肥厚相關(guān)基因的激活、肌節(jié)組裝和蛋白質(zhì)合成增加[5-7]。在心肌肥厚早期，心肌細(xì)胞體積增大，膠原纖維大量合成以維持心臟的正常形態(tài)完整性和功能，但持續(xù)的心肌肥厚可降低心肌順應(yīng)性和心臟功能，從而改變心臟血流動力學(xué)，導(dǎo)致心力衰竭、心律失常甚至猝死的發(fā)生。本研究通過TAC術(shù)建立小鼠心肌肥厚模型，術(shù)后4周和8周的小鼠心臟質(zhì)量明顯增加，超聲提示小鼠心功能下降，組織病理學(xué)結(jié)果表明實(shí)驗組小鼠心肌細(xì)胞橫截面積增加，間質(zhì)膠原蛋白大量沉積，且分布紊亂，與本實(shí)驗室既往研究成果基本一致[8]，表明本研究成功建立了壓力負(fù)荷致心肌肥厚模型。

ADAMTS是一類多結(jié)構(gòu)域基質(zhì)相關(guān)性鋅指金屬蛋白酶，包含19個家族成員，具有相似的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，包括解素樣結(jié)構(gòu)域、金屬蛋白酶催化結(jié)構(gòu)域、I型血小板結(jié)合蛋白富集區(qū)域和重復(fù)序列等[9]。ADAMTS分子結(jié)構(gòu)及蛋白水解作用與基質(zhì)金屬蛋白酶家族類似，調(diào)節(jié)ECM的合成與水解。自ADAMTS家族發(fā)現(xiàn)以來，大量研究表明其與心血管病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Wu等[10]的研究表明，心肌梗死患者血漿ADAMTS7水平與心室重構(gòu)程度和預(yù)后相關(guān)，可作為心肌梗死患者心力衰竭的獨(dú)立危險因素。而Krishnamurthy等[11]發(fā)現(xiàn)，在小鼠彈性蛋白敲除誘導(dǎo)的主動脈瓣膜病模型，ADAMTS5、MMP2和MMP9表達(dá)上調(diào)，ADAMTS5通過促進(jìn)多功能蛋白聚糖異常降解，加快胞外基質(zhì)重塑，最終導(dǎo)致主動脈瓣畸形和瓣膜病的發(fā)生。最近的研究表明，ADAMTS10與纖維蛋白1共定位在人類皮膚，同時與纖維蛋白1相互作用，促進(jìn)其在皮膚成纖維細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)中沉積[12]。本研究結(jié)果證實(shí)ADAMTS10在小鼠心肌組織表達(dá)，且定位在心臟成纖維細(xì)胞，那么ADAMTS10是否參與心肌肥厚調(diào)節(jié)？是否和心肌纖維化有關(guān)系呢？

ADAMTS10最早于小鼠胚胎中被發(fā)現(xiàn)，主要在肺、腎和骨中表達(dá)，具有與其他成員相似的結(jié)構(gòu)，區(qū)別在于其C端存在5個特征性I型血小板結(jié)合蛋白重復(fù)序列[13-14]。研究表明，ADAMTS10基因變異可導(dǎo)致Weill-Marchesani綜合征，是一種罕見的結(jié)締組織病，也稱球形晶狀體短指畸形綜合征，反馬凡綜合征等[15]。Wang等[16]證實(shí)在異丙腎上腺素誘導(dǎo)的離體實(shí)驗?zāi)Ｐ椭校珹DAMTS2的表達(dá)上調(diào)，且沉默ADAMTS2的表達(dá)可減輕異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大。與之類似，本研究使用RT-PCR和Western blotting檢測ADAMTS10在實(shí)驗組4周和8周小鼠心肌組織的表達(dá)情況，結(jié)果表明隨著病程的持續(xù)，在心肌細(xì)胞肥大和心肌纖維化進(jìn)行性加重的同時，ADAMTS10含量也呈進(jìn)行性增加。ANP和β-MHC是心肌肥厚嚴(yán)重程度的指標(biāo)，本研究發(fā)現(xiàn)心肌肥厚小鼠心肌中ADAMTS10 mRNA水平與ANP mRNA和β-MHC mRNA水平均呈正相關(guān)。心肌纖維化是心肌重構(gòu)的重要組成部分，MMP過度降解正常膠原蛋白，導(dǎo)致ECM重構(gòu)，可作為反映心肌纖維化程度的指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)ADAMTS10 mRNA水平與MMP2 mRNA和MMP9 mRNA水平明顯正相關(guān)。因此推測壓力負(fù)荷誘導(dǎo)心肌組織ADAMTS10表達(dá)上調(diào)，繼而升高的ADAMT10通過調(diào)節(jié)ECM的動態(tài)平衡參與心肌肥厚和纖維化的發(fā)生。

局限性：本研究僅做了相關(guān)性分析，未能進(jìn)一步探究ADAMTS10調(diào)控ECM重構(gòu)的具體分子機(jī)制，這也是下一步實(shí)驗的重點(diǎn)研究內(nèi)容。本文的亮點(diǎn)：初步證實(shí)了ADAMTS10在心肌組織表達(dá)，并定位在心肌成纖維細(xì)胞。其次，證實(shí)在壓力負(fù)荷刺激下，ADAMTS10通過調(diào)控ECM重構(gòu)，參與心肌肥厚和纖維化的發(fā)生發(fā)展，提示ADAMTS10可能是逆轉(zhuǎn)心肌肥厚及纖維化的重要靶點(diǎn)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突