脫氫表雄酮抑制血管內膜增生的體內研究

張曼莉，張曼娜，陳慧，趙昆，劉芳，劉志寬，佟飛

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）時，在炎癥、氧化應激等因素作用下，引起內皮損傷、單核細胞黏附、脂質顆粒聚集、泡沫細胞形成和血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）增殖、遷移，最終導致血管內膜增生和粥樣斑塊的形成[1]。血管內膜增生、炎癥與AS、支架術后再狹窄等血管重構性疾病密切相關。有研究報道，Krüppel樣因子5（Krüppel-like factors 5，KLF5）在血管重構性疾病尤其AS中與細胞增殖和炎癥密切相關[2-3]。脫氫表雄酮（dehydroepiandrosterone，DHEA）是人體血液循環(huán)中最豐富的一種類固醇激素。有研究顯示，DHEA可抑制VSMC增殖，在AS過程中發(fā)揮保護作用[4]。那么，在小鼠內皮層完整的血管損傷模型中（如頸動脈結扎或不完全結扎），DHEA是否具有抑制內膜增生和炎癥的作用目前鮮有報道。本文應用小鼠頸動脈結扎法誘導內膜增生模型，觀察DHEA在結扎誘導的內膜增生和局部炎癥應答中的抑制作用。

1 材料與方法

材料及儀器：DHEA（Abcam公司，英國）；鼠抗增殖細胞核抗原（PCNA）單克隆抗體（Abcam公司，英國）；鼠抗腫瘤壞死因子-α（TNF-α）單克隆抗體（Abcam公司，英國）；鼠抗白細胞介素（IL）-6單克隆抗體（Abcam公司，英國）；兔抗KLF5多克隆抗體（GeneTex公司，美國）；鼠抗β肌動蛋白（β-actin）多克隆抗體（Santa Cruz公司，美國）；總RNA提取試劑盒（OMEGA公司，美國）；M-MLV逆轉錄試劑盒（Invitrogen公司，美國）；SYBR Green定量PCR（qPCR）kit（Invitrogen公司，美國）；核酸定量儀（Eppendorf公司，德國）；PCR擴增儀（Eppendorf公司，德國）；ABI 7500 Fast實時熒光定量PCR（qRT-PCR）擴增儀（ABI公司，美國）；電泳儀（Bio-rad公司，美國）；ECL化學發(fā)光儀（Vilber Lourmat 公司，法國）。

動物分組：30只健康雄性18～20周齡C57BL/6小鼠購買于北京維通利華實驗動物技術有限公司（合格證編號11400700128532）。所有實驗動物均受到人道對待，實驗方案獲得實驗動物倫理委員會批準。30只小鼠隨機分為對照組、結扎組和DHEA治療組，每組10只。

動物模型的建立：按照Kumar等[5]報道的方法建立小鼠頸動脈結扎模型： C57BL/6小鼠用2 %異氟烷進行吸入性麻醉；固定小鼠于無菌手術臺上，頸部伸直呈仰臥位，手術部位皮膚去毛，碘伏局部消毒；用無菌剪沿頸正中線剪開皮膚約0.5 cm，顯微彎鑷鈍性分離甲狀腺和肌肉，從近心端向遠心端鈍性分離并暴露左側頸總動脈；結扎組和DHEA治療組在頸外動脈和頸內動脈分叉點用無菌手術線結扎左側頸總動脈；對照組僅把無菌手術線置于左側頸總動脈分叉點下而不結扎。手術傷口用青霉素處理后縫合；術后將小鼠單籠喂養(yǎng)。對照組和結扎組于手術后給予普通飼料。DHEA治療組于手術后第3天開始每天給予含有DHEA的飼料[0.4% W/W，相當于100 mg/（kg·d）]。術后第21天處死小鼠，快速分離小鼠結扎處頸動脈，冷PBS洗凈血液，去除血管外結締組織。用于蘇木素-伊紅染色的組織，用4%多聚甲醛固定。用于qRT-PCR、蛋白免疫印跡實驗的組織-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

蘇木素-伊紅（HE）染色步驟：石蠟切片常規(guī)脫蠟至水；蘇木素染色；1%鹽酸酒精分化；伊紅染色；梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片；鏡下觀察、照相，Image-Pro Plus Analyzer version 5.1軟件（美國）測量并計算頸動脈內膜面積和內膜/中膜面積（I/M）比值。

RNA提取和qRT-PCR：取出凍存的血管組織，用Trizol法提取總RNA，核酸定量儀檢測RNA的純度和濃度。按照美國Invitrogen公司“用于qRT-PCR的M-MLV第一鏈合成系統(tǒng)”操作說明，取1～3 μg總RNA建立20 μg逆轉錄體系合成互補DNA（cDNA）。然后用美國Invitrogen公司的“Platinum SYBR Green qPCR Super Mix-UDG with ROX”試劑盒和ABI 7500 Fast qRT-PCR擴增儀進行熒光擴增。相對定量的方法采用比較Ct法，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內參，采用△Ct（Ct目的-Ct內參）法進行相對定量分析，以2-△Ct作為目的RNA的相對表達量。引物序列見表1。

蛋白免疫印跡實驗分析：提取各組小鼠組織總蛋白，用改良的Lowry法進行蛋白定量。取等量蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳，之后進行半干轉膜。轉膜完畢，取出聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，放置在含5 %脫脂奶粉的Tween 20/TBS（TBST）封閉液中，于室溫封閉2 h后，將封閉后的PVDF膜用TBST適當漂洗，然后放入用一抗稀釋液稀釋的一抗中，4℃放置過夜。次日，取出PVDF膜用TBST適當漂洗，將PVDF膜置入用適當TBST稀釋的化學發(fā)光二抗中，室溫反應2 h，取出PVDF膜用TBST適當漂洗。最后用化學發(fā)光儀檢測抗體特異結合條帶。信號強度用Image J軟件進行相對定量分析。用Graph Pad Prism 5軟件作圖。

統(tǒng)計學方法：采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學處理分析，計量資料均經(jīng)正態(tài)性及方差齊性檢驗，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組之間均數(shù)的統(tǒng)計學差異采用Student's t檢驗分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

三組小鼠頸動脈的形態(tài)學分析結果（圖1、表2）：結扎組與對照組相比，頸動脈內膜面積[（4.05±0.26）×104μm2vs （0.47±0.05）×104μm2]顯 著 增 大，I/M比 值（2.85±0.19 vs 0.14±0.02）顯著升高；DHEA治療組與結扎組相 比，內 膜 面 積[（1.16±0.17）×104μm2vs（4.05±0.26）×104μm2]減小，I/M比值（0.78±0.15 vs 2.85±0.19）明顯降低；上述組間差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。

三組小鼠頸動脈組織中PCNA的mRNA和蛋白表達情況（表3、圖2）：結扎組與對照組相比，頸動脈組織中PCNA的mRNA（2.96±0.07 vs 1.00±0.01）和蛋白（3.21±0.22 vs 1.00±0.01）表達水平明顯升高；DHEA治療組與結扎組相比，頸動脈組織中PCNA的mRNA（1.42±0.09 vs 2.96±0.07）和蛋白（1.39±0.19 vs 3.21±0.22）表達水平顯著降低；上述組間差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。

圖1 三組小鼠頸動脈的蘇木素-伊紅染色結果（×10）

表2 三組小鼠頸動脈內膜面積和內膜/中膜面積比值(n=10,

表2 三組小鼠頸動脈內膜面積和內膜/中膜面積比值(n=10,

注：與對照組比較*P＜0.05；與結扎組比較△P＜0.05

項目 對照組 結扎組 DHEA治療組內膜面積(×104 μm2) 0.47±0.05 4.05±0.26* 1.16±0.17△內膜/中膜面積比值 0.14±0.02 2.85±0.19* 0.78±0.15△

表3 三組小鼠頸動脈組織中PCNA的mRNA表達水平(n=10,

表3 三組小鼠頸動脈組織中PCNA的mRNA表達水平(n=10,

注：PCNA：增殖細胞核抗原；mRNA：信使RNA；DHEA：脫氫表雄酮。與對照組比較*P＜0.05；與結扎組比較△P＜0.05

PCNA mRNA表達水平 1.00±0.01 2.96±0.07* 1.42±0.09△

圖2 三組小鼠頸動脈組織中PCNA蛋白電泳結果（2A） 和表達水平（2B）

三組小鼠頸動脈組織中TNF-α和IL-6的mRNA和蛋白表達情況（表4、圖3）：結扎組與對照組相比，頸動脈組織中TNF-α的mRNA（3.05±0.09 vs 1.00±0.01）和蛋白（3.75±0.30 vs 1.00±0.01）表達水平顯著升高，IL-6的mRNA（2.79±0.07 vs 1.00±0.01）和蛋白（3.01±0.28 vs 1.00±0.01）表達水平也顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。DHEA治療組與結扎組相比，頸動脈組織中TNF-α的mRNA（1.28±0.08 vs 3.05±0.09）和蛋白（1.49±0.26 vs 3.75±0.30）表達水平明顯降低，IL-6的mRNA（1.31±0.09 vs 2.79±0.07）和蛋白（1.24±0.19 vs 3.01±0.28）表達水平也明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。

表4 三組小鼠頸動脈組織中TNF-α和IL-6的mRNA表達水平(n=10，

表4 三組小鼠頸動脈組織中TNF-α和IL-6的mRNA表達水平(n=10，

注：TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL-6：白細胞介素-6；mRNA：信使RNA；DHEA：脫氫表雄酮。與對照組比較*P＜0.05；與結扎組比較△P＜0.05

TNF-α mRNA表達水平 1.00±0.01 3.05±0.09* 1.28±0.08△IL-6 mRNA表達水平 1.00±0.01 2.79±0.07* 1.31±0.09△

圖3 三組小鼠頸動脈組織中TNF-α和IL-6蛋白電泳結果（3A） 和表達水平（3B）

三組小鼠頸動脈組織中KLF5的mRNA和蛋白表達情況（表5、圖4）：結扎組與對照組相比，頸動脈組織中KLF5的mRNA（2.64±0.07 vs 1.00±0.01）和蛋白（3.89±0.34 vs 1.00±0.01）表達水平顯著升高，分別升高約2.6倍和3.9倍，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）；DHEA治療組與結扎組相比，頸動脈組織中KLF5的mRNA（1.38±0.06 vs 2.64±0.07）和蛋白（1.67±0.21 vs 3.89±0.34）表達明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。

表5 三組小鼠頸動脈組織中KLF5的mRNA表達水平（n=10

表5 三組小鼠頸動脈組織中KLF5的mRNA表達水平（n=10

注：KLF5：Krüppel樣因子5；mRNA：信使RNA；DHEA：脫氫表雄酮。與對照組比較*P＜0.05；與結扎組比較△P＜0.05

KLF5 mRNA表達水平 1.00±0.01 2.64±0.07* 1.38±0.06△

注：DHEA：脫氫表雄酮；KLF5：Krüppel樣因子5；β-actin：β肌動蛋白。與對照組比較*P＜0.05；與結扎組比較△P＜0.05

3 討論

心腦血管疾病是當今社會威脅人類健康的主要疾病之一，其發(fā)病率和死亡率呈逐年升高趨勢[6]。病理性血管重構可導致多種血管疾?。òˋS、高血壓、動脈瘤等）發(fā)生、發(fā)展，其中AS是心腦血管疾病的主要病理基礎。在AS的發(fā)生、發(fā)展和并發(fā)癥發(fā)生中，局部和全身的炎癥以及細胞增殖起著重要作用。AS形成的最早期表現(xiàn)為脂質條紋形成：內皮細胞導致的特異性黏附分子表達引起白細胞趨化，趨化的單核細胞或巨噬細胞觸發(fā)產(chǎn)生IL-1、TNF-α和IL-6等炎癥因子。炎癥細胞遷移到內皮下引起上述細胞因子釋放，刺激VSMC增殖，引起斑塊進展，導致管腔狹窄、斑塊破裂、血栓形成[7-8]。研究表明，抑制反映細胞增殖狀態(tài)的增殖相關基因（PCNA）和炎癥相關基因（IL-1β、IL-6）的表達可阻止AS的發(fā)生、發(fā)展[8-9]。盡管有諸多關于AS的研究，但迄今為止，AS的發(fā)病機制仍不完全清楚。由于內膜增生和炎癥在AS發(fā)生和發(fā)展中起重要作用，因此研究具有抑制血管內膜增生和炎癥雙重作用的藥物就更加讓人期待。

KLF家族中的KLF5在不同組織中廣泛表達，是一種促細胞增殖的轉錄因子，在血管重構中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤發(fā)育和AS形成過程中，KLF5可以促進細胞增殖[10-11]。此外，KLF5與炎癥也密不可分。前期體內和體外研究發(fā)現(xiàn)，在血管重構過程中，高糖通過上調KLF5的表達，進而促進TNF-α等炎癥基因表達[12]。Chen等[13]的研究也證明了KLF5可促進炎癥因子的表達。由此可見，無論在腫瘤還是AS的發(fā)生、發(fā)展過程中，KLF5與細胞增殖和炎癥都密切相關。因此，研發(fā)一種可以抑制KLF5表達、同時抑制細胞增殖和炎癥的藥物，將為AS的預防和治療提供新的思路。

DHEA是成年人體內循環(huán)中最豐富的甾體激素，主要以脫氫表雄酮硫酸酯（DHEA-S）的形式進入血液循環(huán)中，在外周組織中轉化為雄激素或雌激素發(fā)揮間接生物學效應。流行病學研究表明，血漿DHEA-S水平與AS發(fā)病率、心血管疾病全因死亡風險以及致死性、非致死性心血管事件的發(fā)生率呈負相關，在男性中尤為突出[14-15]。有研究發(fā)現(xiàn)，DHEA通過抗細胞增殖來治療肺動脈高壓[16]。那么，DHEA在AS形成過程中能否抑制血管重構以及如何發(fā)揮抑制作用？DHEA是否具有抑制增殖相關基因（PCNA）和炎癥相關基因（TNF-α和IL-6）的表達而發(fā)揮抑制血管內膜增生和炎癥雙重作用？結合本課題組前期研究結果，DHEA能否影響有促細胞增殖、促炎作用的KLF5的表達？為了研究這些問題，本研究采用了雄性小鼠頸動脈結扎的血管內膜增生模型，觀察DHEA對增殖相關基因（PCNA）、炎癥相關基因（TNF-α和IL-6）和KLF5表達的影響，探討DHEA對血管內膜增生、血管炎癥和KLF5的作用。結果顯示，形態(tài)學觀察到DHEA可明顯抑制血管內膜增生，在mRNA和蛋白質水平，DHEA顯著抑制增殖相關基因（PCNA）、炎癥相關基因（TNF-α和IL-6）和KLF5的表達，證明了DHEA具有抑制血管增生和炎癥的雙重作用。由此推測，DHEA發(fā)揮抑制血管內膜增生和炎癥因子的表達可能一定程度上是通過抑制KLF5的表達來實現(xiàn)的，但DHEA是直接還是間接發(fā)揮此作用，以及其中具體的分子機制，尚需進一步的研究來證實。

綜上所述，我們通過小鼠體內研究發(fā)現(xiàn)，DHEA能夠抑制血管內膜增生和炎癥因子的表達，DHEA還可以抑制轉錄因子KLF5的表達。因此推測，DHEA發(fā)揮抑制AS的作用一定程度上是通過抑制有促細胞增殖和促炎作用的KLF5來實現(xiàn)的。本研究為揭示DHEA抑制AS的發(fā)生機制，為防治AS提供了新的思路。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突