生鮮乳中黃曲霉毒素M1 液質(zhì)檢測方法

左英芳，馬超越，張 昕，張 佳

（焦作市畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測中心，河南 焦作 454003）

1 藥物概述

黃曲霉毒素M1（AFM1）主要由哺乳動(dòng)物食用了發(fā)霉的花生、大豆、玉米等（含有黃曲霉毒素B1）的飼料，并在其體內(nèi)代謝產(chǎn)生。其具有強(qiáng)致突變性、致畸形、致癌性“三致”作用，長期攝入可誘發(fā)肝癌。故各國對乳及乳制品中的AFT M1做了嚴(yán)格的限定。世界多數(shù)采取兩種限量，即0.05μg/kg和0.5μg/kg。中國與美國基本一致，均為0.5μg/kg；歐盟成員國相對較嚴(yán)格為0.05μg/kg，歐盟對特殊膳食用品則限量0.025μg/kg。

2 黃曲霉毒素M1的檢測方法

2.1 原理

試樣中的AFM1和13C17-AFM1用乙腈提取后離心氮吹，經(jīng)Bond Elut Plexa固相萃取柱凈化和富集，凈化液濃縮、定容和過濾后經(jīng)液相色譜分離，串聯(lián)質(zhì)譜檢測，同位素內(nèi)標(biāo)法定量。

2.2 實(shí)驗(yàn)材料

2.2.1 試劑及溶液：甲醇、乙腈為色譜純；實(shí)驗(yàn)用水為滿足國家規(guī)定的實(shí)驗(yàn)室一級水；正己烷、丙酮、二氯甲烷為分析純。

2.2.2 AFM1標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥98%，或經(jīng)國家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。13C17-AFM1同位素溶液：0.5μg/ml。

2.2.3 儀器設(shè)備：天平：感量0.001g和0.00001g；離心機(jī)（德國Sigma），HY-3多功能振蕩器（江蘇金壇）；固相萃取裝置；氮吹儀；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀；一次性微孔濾頭：0.22μm微孔濾膜；Bond Elut Plexa固相萃取柱3ml/60mg。

2.3 實(shí)驗(yàn)步驟

2.3.1 提取：稱取5g混合均勻的試樣（精確到0.001g）于50ml離心管中，加入100μL13C17-AFM1內(nèi)標(biāo)溶液（10ng/ml），加入15ml乙腈，渦旋振蕩10min。14000r/min離心5min，取上清液10ml于離心管中，置于50℃水浴中吹至2ml以下，待凈化。

2.3.2 凈化：依次用3.5ml甲醇、3.5ml水活化Bond Elut Plexa固相萃取柱。上樣，加3.5ml水淋洗，抽干，加3.5ml正己烷淋洗（除脂），抽干。用20%丙酮二氯甲烷溶液4ml洗脫，收集洗脫液于離心管中。

2.3.3 復(fù)溶：洗脫液于50℃水浴下用氮?dú)獯蹈桑瑲堄辔镉?0%乙腈溶液0.5ml溶解，渦旋混勻，取上清液過0.22μm濾膜，用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定，內(nèi)標(biāo)法定量。

2.4 液相及質(zhì)譜條件

2.4.1 液相色譜條件：液相色譜柱：Acquity UPLC BEHC18（1.7μm，2.1mm×50mm）。柱溫：35℃。流動(dòng)相：A：乙腈；B：水。進(jìn)樣量：5μl。

梯度洗脫如下：

時(shí)間（min） 流速（ml/min） A% B% 曲線類型/0.3 10 90 /3.00 0.3 35 65 6 4.00 0.3 90 10 6 5.00 0.3 10 90 1

2.4.2 質(zhì)譜參考條件：毛細(xì)管電壓：3.00 kV；萃取補(bǔ)償電壓：44V；源溫：150℃；霧化溫度：450℃；霧化氣流速：1000 L/hr。

質(zhì)譜參數(shù)如下：

藥物名稱 離子源 定性離子對（m/z）定量離子對（m/z）錐孔電壓（V）碰撞能量（eV）AFM1 ESI+329.09＞229.13 329.09＞259.00 329.09＞273.11 329.09＞229.13 48 38 20 13C17- AFM1 ESI+ 346.20＞288.21 346.20＞272.93 346.20＞272.93 16 2224

3 特點(diǎn)對比

本實(shí)驗(yàn)采用了Bond Elut Plexa固相萃取柱替代免疫親和柱，現(xiàn)就兩種方法的優(yōu)劣進(jìn)行比較如下：

（1）提取溶劑由國標(biāo)的甲醇改變?yōu)橐译?。過柱液體也由國標(biāo)的40ml變?yōu)楝F(xiàn)在的3ml，極大的節(jié)約了過柱的時(shí)間成本。

（2）免疫親和柱的儲存條件要求在4℃的條件下冷藏保存，相對只需常溫保存的固相萃取柱而言條件十分苛刻。且免疫親和柱的成本極高，改變條件后極大的節(jié)約了樣品的檢測成本。

（3）凈化液類型上增加了正己烷和20%丙酮-二氯甲烷，由于該兩種物質(zhì)有較強(qiáng)的毒副作用和環(huán)境污染，故要求實(shí)驗(yàn)人員做好相應(yīng)的保護(hù)措施和廢液處理措施。

（4）免疫親和柱的選擇性較高，在色譜圖的響應(yīng)高。Bond Elut Plexa固相萃取選擇性低，在色譜圖的響應(yīng)較低，但可以滿足國標(biāo)上的檢測定量要求。

4 總結(jié)

本實(shí)驗(yàn)方法是基于實(shí)驗(yàn)室有大批量樣品時(shí)，為盡快處理樣品并節(jié)約檢測成本的情況下，進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)方法改善。本實(shí)驗(yàn)方法也有選擇性低、響應(yīng)性低等不足之處，在今后的實(shí)驗(yàn)過程中希望完善不足之處。