百香果果漿內(nèi)生細(xì)菌的分離鑒定及生長(zhǎng)條件的研究

陳正培，吳婉瑩，張 銀，向 煜，余啟明，蔡錦源，熊建文*

（廣西科技大學(xué) 鹿山學(xué)院 食品與化學(xué)工程系，廣西 柳州 545616）

百香果（Passionfora edulis）屬于西番蓮科，又稱雞蛋果、巴西果，其主產(chǎn)于熱帶和亞熱帶地區(qū)，于1913年引入我國(guó)。目前在臺(tái)灣、福建、廣西、云南等地均有種植，且得到了大力發(fā)展[1-2]。百香果主要分為紫色百香果和黃色百香果，其中紫色百香果在市面上更為常見[3]。百香果果汁豐富，香味濃郁，含有豐富的揮發(fā)性香味成分，PERESTRELOR等[4]研究表明，百香果香味成分達(dá)到103種，其中包含了蘋果、香蕉等水果中的主要香味成分，百香果也是因此而得名，并享有“果汁之王”的美譽(yù)[5-6]。百香果營(yíng)養(yǎng)成分豐富，不僅含有7種人體必需氨基酸、多種對(duì)人體有益的礦物質(zhì)元素（Na、K、Ca 、Mg、Zn、Fe、Ge），還含有豐富的蛋白質(zhì)、膳食纖維、維生素C、維生素E和糖類等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[7-8]。

百香果果汁偏酸，不宜直接食用，因此其果漿常被加工成果汁飲品。為了豐富百香果果汁飲品的種類，滿足人們對(duì)生活質(zhì)量日益提高的要求，對(duì)百香果果汁研究從單一的果汁飲料逐漸向復(fù)合的果汁飲料轉(zhuǎn)變。如將百香果分別與芒果、菠蘿、雪梨、黃瓜、火龍果、沙田柚等水果研制成復(fù)合果汁飲品[9-17]。此外，石小瓊等[18]研發(fā)了糯米百香果果酒；楊玉霞等[19-21]對(duì)百香果果酒的發(fā)酵進(jìn)行了探索，均得到了較好的發(fā)酵工藝；潘嫣麗等[22]對(duì)百香果果醋進(jìn)行了研發(fā)。目前，對(duì)百香果果漿的研究主要集中在成分分析、果汁加工工藝、果汁的保藏等方面，然而對(duì)百香果果漿中的內(nèi)生菌研究鮮見報(bào)道。陸小平等[23]分別從香蕉、柑橘中分離到的內(nèi)生細(xì)菌對(duì)常見的植物病原菌具有一定的拮抗作用，而百香果果汁存在的內(nèi)生細(xì)菌是否有類似的作用，百香果內(nèi)生細(xì)菌對(duì)深加工有何影響等問題尚不清楚。因此，對(duì)百香果果汁內(nèi)生菌的分離和鑒定具有一定的研究?jī)r(jià)值。

本研究以柳州地區(qū)紫色百香果鮮果為原料，采用平板計(jì)數(shù)瓊脂（plate countagar，PCA）培養(yǎng)基從百香果中分離純化得到內(nèi)生細(xì)菌，通過分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)其進(jìn)行菌種鑒定，并對(duì)其生長(zhǎng)條件進(jìn)行研究。通過對(duì)百香果果漿內(nèi)生菌的研究，可以為后續(xù)解決百香果果漿加工過程中發(fā)生的內(nèi)源性微生物污染提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

新鮮百香果：種植于柳州地區(qū)的紫色百香果。

1.1.2 試劑

蛋白胨、酵母提取物（均為生化試劑）：廣東環(huán)凱微生物有限公司；瓊脂粉（生化試劑）：北京索來寶生物有限公司；瓊脂糖（分析純）：法國(guó)BIOWEST公司；2×MasterM ix：美國(guó)Thermo公司；Ⅱ型核酸染料：北京派拓科技有限公司；脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：天根生化試劑（北京）有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

平板計(jì)數(shù)瓊脂（液）培養(yǎng)基：胰蛋白胨5 g，酵母浸粉2.5 g，葡萄糖1.0 g，蒸餾水1 L。

LB固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L。LB液體培養(yǎng)基中不加入瓊脂。

牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl5 g，蒸餾水1 L。

以上培養(yǎng)基均在121℃條件下滅菌20min。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1800型紫外可見分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；L9800聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀（polymerase chain reaction，PCR儀）：萊普特科學(xué)儀器（北京）有限公司；Nikon Eclipse E200光學(xué)顯微鏡：上海衡浩儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

選取成熟度一致、表面無任何機(jī)械損傷、大小均勻的新鮮的百香果作為實(shí)驗(yàn)材料，在超凈工作臺(tái)中，先用無菌水沖洗百香果表面，再將百香果放置在裝有體積分?jǐn)?shù)75%乙醇的燒杯中，浸泡5～10min，取出，無菌水果刀切掉端部，用無菌槍頭輕戳百香果果肉，使之溢出果漿，再吸取鮮濃果漿至無菌離心管中。

1.3.2 內(nèi)生細(xì)菌的分離與純化

在無菌條件下，取2m L新鮮百香果果漿涂布于PCA培養(yǎng)基上，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～24 h，挑選單菌落，采用平板劃線法將其純化兩次，獲得目的菌株。

1.3.3 目標(biāo)菌株的分子生物學(xué)鑒定

將目標(biāo)菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，于28℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)過夜，菌液室溫條件下8000 r/min離心1min，去掉上清液，取沉淀，采用DNA提取試劑盒提取菌株的DNA。以其為模板，采用引物27F（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）對(duì)其16SrDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：2×PCRM ix 10.0μL，27F 0.5μL，1492R 0.5μL，模板DNA 1.0μL，雙蒸水（ddH2O）8.0μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5min；98℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，共循環(huán)30次；72℃再延伸5min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至華大基因生物公司進(jìn)行測(cè)序。

測(cè)序結(jié)果在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（national center forbiotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST同源性搜索，選取同源性較高的模式菌株的16S rDNA序列，采用軟件MEGA6.0中的鄰接（neighborjoining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 目標(biāo)菌株生長(zhǎng)條件的研究

培養(yǎng)基的選擇：從平板上挑選目標(biāo)菌株分別接種到pH值為7.0的9.9m LLB液體培養(yǎng)基、不添加瓊脂的PCA培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，28℃、200 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)10 h。然后按1%（V/V）的接種量接種至對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基中，28℃、200 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)12 h，用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定吸光度值（OD600nm值）。

最適生長(zhǎng)pH的測(cè)定：用無菌接種環(huán)取試管中保存的目標(biāo)菌株1環(huán)，接種到LB培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)10 h，測(cè)定菌液在波長(zhǎng)600nm處的吸光度值，調(diào)整菌液的OD600nm值為0.6，將其作為種子液。然后將目標(biāo)菌株按1%的接種量接種于不同pH值（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0）的LB液體培養(yǎng)基中，在28 ℃、200 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)12 h，測(cè)定OD600nm值。

最適生長(zhǎng)溫度的測(cè)定：將目標(biāo)菌株按1%的接種量接種于pH值為5.5的LB液體培養(yǎng)基中，然后分別置于15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃，200 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)12h，測(cè)定OD600nm值。

生長(zhǎng)曲線的測(cè)定：將目標(biāo)菌株按照1%的接種量接種于pH 5.5的LB液體培養(yǎng)基中，在35℃、200 r/min的條件下恒溫振蕩培養(yǎng)，每隔2 h測(cè)定OD600nm值。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；采用Origin 9.1進(jìn)行圖形的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生細(xì)菌的分離及鑒定

2.1.1 形態(tài)觀察

利用PCA培養(yǎng)基對(duì)百香果果漿中的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分離、純化，得到形態(tài)均一的淺黃色菌落。選取3株特征菌株（編號(hào)為GJ2-5、GJ2-13、GJ2-19）進(jìn)行菌種鑒定。其在LB培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)見圖1。由圖1A可知，3株細(xì)菌在LB培養(yǎng)基上的單菌落均為圓形，表面潤(rùn)滑，菌落隆起，菌落呈淺黃色不透明狀。由圖1B可知，3株菌均為短桿型革蘭氏陽性細(xì)菌，菌體長(zhǎng)1.5～2.0μm、寬0.5～0.8μm，兩端鈍圓。絕大多數(shù)單個(gè)存在，也有成串排列。

圖1 菌株GJ2-5、GJ2-13、GJ2-19的菌落形態(tài)（A）及細(xì)胞形態(tài)（B）Fig.1 Colonialmorphology(A)and cellm orphology(B)of strain GJ2-5,GJ2-13 and GJ2-19

2.1.2 分子生物學(xué)鑒定

分別以菌株GJ2-5、GJ2-13、GJ2-19的基因組DNA為模板，以細(xì)菌鑒定通用引物27F及1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果見圖2。由圖2可知，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均在1 500 bp左右，與預(yù)期結(jié)果相符，送去測(cè)序。

圖2 16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gelelectrophoresis of 16S rDNA PCR products

圖3 基于16S rDNA序列3株菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of 3 strains based on 16S rDNA sequences

百香果果漿內(nèi)生細(xì)菌GJ2-5、GJ2-13、GJ2-19的16SrDNA序列經(jīng)同源性比對(duì)，選取同源性較高的模式菌株的16SrDNA基因序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖3。由圖3可知，3株菌均屬于泛菌屬（Pantoea），其中，菌株GJ2-5和GJ2-13均與分散泛菌（Pantoea dispersa）聚于一支，親緣關(guān)系最近，因此，鑒定菌株GJ2-5、GJ2-13為分散泛菌（Pantoeadispersa）。菌株GJ2-19與Pantoea eucrina聚于一支，親緣關(guān)系最近，因此鑒定菌株GJ2-19為Pantoeaeucrina。

2.2 百香果果漿內(nèi)生細(xì)菌培養(yǎng)條件的研究

2.2.1 培養(yǎng)基的選擇

圖4 百香果果漿內(nèi)生細(xì)菌生長(zhǎng)培養(yǎng)基的選擇Fig.4 Selection of grow th medium of endophytic bacteria from passion fruit pulp

由圖4可知，3株內(nèi)生細(xì)菌在3種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況均呈現(xiàn)LB培養(yǎng)基＞PCA培養(yǎng)基＞牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的趨勢(shì)，且在LB培養(yǎng)基與PCA培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況差異極顯著（P＜0.01）。因此，LB培養(yǎng)基更適合用于3株百香果果漿內(nèi)生細(xì)菌的培養(yǎng)。

2.2.2 最適生長(zhǎng)pH值的選擇

圖5 百香果果漿內(nèi)生細(xì)菌最適生長(zhǎng)pH值的測(cè)定Fig.5 Determ ination of optimalgrow th pH of endophytic bacteria from passion fruit pulp

由圖5可知，該3株內(nèi)生細(xì)菌在pH 4.0～9.0之間生長(zhǎng)良好，其最適pH值均為5.5，但在pH 3.0以下其生長(zhǎng)均受到強(qiáng)烈的抑制。百香果果漿的pH在2.0～3.0之間，說明從百香果果漿中分離到的泛菌具有較強(qiáng)的耐酸性，百香果鮮果果漿可抑制泛菌屬的生長(zhǎng)，但不能殺死該泛菌屬。

2.2.3 最適生長(zhǎng)溫度

圖6 百香果果漿內(nèi)生細(xì)菌最適生長(zhǎng)溫度的測(cè)定Fig.6 Determ ination of optimalgrow th temperature of endophytic bacteria from passion fruit pulp

由圖6可知，3株內(nèi)生細(xì)菌在培養(yǎng)溫度為24～40℃之間均呈現(xiàn)良好的生長(zhǎng)狀況，在該范圍內(nèi)其生長(zhǎng)受溫度變化的影響小，屬于中溫型細(xì)菌，且最適生長(zhǎng)溫度均為35℃。但當(dāng)溫度低于24℃之前（或高于40℃之后），其生物量隨著溫度的降低（或溫度的升高）呈現(xiàn)顯著下降的趨勢(shì)（P＜0.05），即在低溫下和在高溫下對(duì)溫度的敏感性明顯增強(qiáng)。

2.2.4 生長(zhǎng)曲線

圖7 百香果果漿內(nèi)生細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線Fig.7 Grow th curves of endophytic bacteria from passion fruit pulp

由圖7可知，這3株內(nèi)生細(xì)菌的生長(zhǎng)趨勢(shì)一致，均在接種后的6h以內(nèi)生長(zhǎng)緩慢，處于適應(yīng)期，該時(shí)期細(xì)菌主要進(jìn)行細(xì)胞分裂必需物質(zhì)的準(zhǔn)備；在6～18h范圍內(nèi)快速生長(zhǎng)，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，主要進(jìn)行細(xì)胞分裂；在18～22h范圍內(nèi)處于平穩(wěn)期，主要進(jìn)行次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成；22 h以后進(jìn)入衰亡期。

3 結(jié)論

本研究利用PCA培養(yǎng)基從百香果果漿中分離得到3株菌落形態(tài)單一、均呈淺黃色的內(nèi)生細(xì)菌，編號(hào)為GJ2-5、GJ2-13、GJ2-19，經(jīng)革蘭氏染色，均呈革蘭氏陽性。通過分子生物學(xué)鑒定，鑒定3株內(nèi)生細(xì)菌均為泛菌屬（Pantoea），其中菌株GJ2-5和GJ2-13均為分散泛菌（Pantoea dispersa），菌株GJ2-19為Pantoeaeucrina。同時(shí)，對(duì)這3株菌的生長(zhǎng)條件進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，3株內(nèi)生細(xì)菌的最適生長(zhǎng)培養(yǎng)基為L(zhǎng)B液體培養(yǎng)基，最適生長(zhǎng)pH值為5.5，最適生長(zhǎng)溫度為35℃，生長(zhǎng)周期為遲滯期（0～6 h）、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（6～18 h）、平穩(wěn)期（18～22 h）和衰亡期（22 h以后）。