Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)優(yōu)化復(fù)合豆?jié){酒發(fā)酵工藝

周書來，王 琪，劉琨毅*，張婉琪，吳 麗

（1.樂山職業(yè)技術(shù)學(xué)院 藥學(xué)系，四川 樂山 614000；2.宜賓職業(yè)技術(shù)學(xué)院 五糧液技術(shù)學(xué)院，四川 宜賓 644003；3.樂山豐野農(nóng)業(yè)科技有限責(zé)任公司，四川 樂山 614000；4.樂山市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，四川 樂山 614000）

我國(guó)傳統(tǒng)的乳酒都是以馬奶或羊奶為原料，以開菲爾?；蚪湍妇c乳酸菌的混合菌為發(fā)酵劑生產(chǎn)的一類含酒精的飲品[1-4]。市場(chǎng)上銷售的乳酒，往往存在酸度普遍偏高的不良特性[5-8]。利用豆類原料制得的豆?jié){與馬奶或羊奶相比，含有較為豐富的植物蛋白質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是馬奶或羊奶理想的替代品，也是近年來研究的熱點(diǎn)[9-11]。豆?jié){酒作為一種含有酒精的復(fù)合飲料，既補(bǔ)充了我國(guó)居民因牛乳等動(dòng)物蛋白攝入不足的缺陷，又比傳統(tǒng)的乳酒口感更加柔和[12-14]。

復(fù)合型發(fā)酵酒是使用兩種或兩種以上的釀酒原料發(fā)酵而成的酒品，其能綜合兩種或兩種以上原料的特點(diǎn)與優(yōu)勢(shì)，彌補(bǔ)利用單一原料釀酒在色、香、味上的欠缺和營(yíng)養(yǎng)成分不足等缺陷[15-16]。因復(fù)合型發(fā)酵酒利用了多種釀造原料，并采用先進(jìn)的釀造工藝，使其風(fēng)味獨(dú)特，深受消費(fèi)者的喜愛[8，16]。黃豆因其含有豐富的蛋白質(zhì)、微量元素及異黃酮類物質(zhì)，因而成為制作豆?jié){的主要原料[17]。然而，傳統(tǒng)豆?jié){中存在的豆腥味極大限制了其應(yīng)用和推廣[18-19]。綠豆是我國(guó)傳統(tǒng)藥食兼用的食材，有“食中佳品，濟(jì)世長(zhǎng)谷”之美稱，具有清熱、消暑、解毒、保肝等功能。雖然傳統(tǒng)煮制工藝中綠豆溶出物含量較黃豆低，但其豆腥味卻沒有黃豆?jié){明顯[20-21]。符楨華等[13]利用豆?jié){制作的豆?jié){酒能在一定程度上消除豆?jié){制品豆腥味，為豆類原料制作酒類產(chǎn)品提供了新的思路。

本試驗(yàn)以釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）為發(fā)酵劑，通過黃豆?jié){與綠豆?jié){混合發(fā)酵釀造復(fù)合豆?jié){酒，利用單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)其發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期釀出風(fēng)味獨(dú)特、酒體圓潤(rùn)、諸味協(xié)調(diào)的復(fù)合豆?jié){酒，為工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）滬釀2.069：宜賓職業(yè)技術(shù)學(xué)院菌種保藏中心；黃豆、綠豆、白砂糖：市售；冰乙酸、乙酸鈉、檸檬酸、檸檬酸鈉、磷酸氫鈉、氫氧化鈉（均為分析純）：湖北鑫潤(rùn)德化工有限公司；亞硫酸鈉（分析純）：南京試劑有限公司；硫酸銅、酒石酸鉀鈉（均為分析純）：無錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司；次甲基藍(lán)（指示劑）：天津市福晨化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

JYL-C91T型豆?jié){機(jī)：九陽股份有限公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；FA20043型電子天平：上海越平科學(xué)儀器有限公司；LXJ-IIB低速大容量多管離心機(jī)：鄭州長(zhǎng)城工貿(mào)有限公司；MC-GNP-9080系列隔水式恒溫培養(yǎng)箱：青島明成環(huán)?？萍加邢薰荆籇SX-280A型不銹鋼手提式滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；KL-30-10000型乳化均質(zhì)機(jī)：上?？苿跈C(jī)械設(shè)備有限公司；BCD-2HBSA型電冰箱：青島海爾股分有限公司；PHs-3c型精密pH計(jì)：上海理達(dá)儀器廠；AT6000型酒精度測(cè)試儀：意大利蓋博分析儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 復(fù)合豆?jié){酒釀造工藝流程及操作要點(diǎn)

操作要點(diǎn)：挑選顆粒成熟飽滿的黃豆和綠豆，去除其中的雜質(zhì)，清水洗凈后用5倍質(zhì)量的清水浸泡9～12 h；將浸泡好的黃豆和綠豆分別加水磨漿過濾后，以黃豆?jié){為基準(zhǔn)，添加一定比例的綠豆?jié){，并添加一定比例的白砂糖及0.02%的亞硫酸鈉，利用檸檬酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH為6.5，攪拌至白砂糖完全溶解，加熱至60℃，采用乳化均質(zhì)機(jī)（壓力為15MPa）均質(zhì)，均質(zhì)后在95℃條件下加熱殺菌5min；待樣品冷卻后，在無菌條件下接入一定量的經(jīng)活化后的酵母菌懸液，25℃條件下發(fā)酵，待發(fā)酵完成后置于4℃的冰箱中后熟24h。

1.3.2 理化指標(biāo)測(cè)定方法[22]

總糖含量（以葡萄糖計(jì)）測(cè)定：斐林試劑法；酒精體積分?jǐn)?shù)測(cè)定：密度瓶法；總酸含量測(cè)定：電位滴定法；氨基酸態(tài)氮含量測(cè)定：甲醛滴定法。

1.3.3 感官評(píng)價(jià)

邀請(qǐng)13位教師及實(shí)驗(yàn)員組成評(píng)定小組，明確感官評(píng)定的指標(biāo)和注意事項(xiàng)。參照符楨華等[13-14]對(duì)豆?jié){酒的研究方法及GB/T 23546—2009《奶酒》標(biāo)準(zhǔn)[22]從色澤、組織形態(tài)、香氣、滋味、典型性5個(gè)方面制定復(fù)合豆?jié){酒感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，滿分為100分，評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

表1 復(fù)合豆?jié){酒的感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standards of compound soym ilk liquor

1.3.4 復(fù)合豆?jié){酒發(fā)酵工藝條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

以黃豆?jié){為基準(zhǔn)，依次考察白砂糖添加量（6%、8%、10%、12%、14%）、綠豆?jié){添加量（5%、10%、15%、20%、25%）、釀酒酵母接種量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）及發(fā)酵時(shí)間（4 d、5 d、6 d、7 d、8 d）對(duì)復(fù)合豆?jié){酒感官評(píng)分的影響，以確定較佳的白砂糖添加量、綠豆?jié){添加量、釀酒酵母接種量、發(fā)酵時(shí)間。

1.3.5 復(fù)合豆?jié){酒發(fā)酵工藝條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取白砂糖添加量（A）、綠豆?jié){添加量（B）、釀酒酵母接種量（C）、發(fā)酵時(shí)間（D）為考察因素，以感官評(píng)分（Y）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[23]，進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，確定復(fù)合豆?jié){酒最佳的發(fā)酵工藝條件，因素與水平見表2。

表2 復(fù)合豆?jié){酒發(fā)酵工藝條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface experiments for fermentation process optim ization of compound soym ilk liquor

1.3.6 數(shù)據(jù)分析處理方法

以上每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。采用OriginPro 10.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)制圖和統(tǒng)計(jì)分析。采用Design Expert 11.1.0.1軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合豆?jié){酒發(fā)酵工藝條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 白砂糖添加量對(duì)復(fù)合豆?jié){酒感官評(píng)分的影響

控制處理?xiàng)l件為綠豆?jié){添加量15%、釀酒酵母接種量0.3%、發(fā)酵時(shí)間6 d，考察白砂糖添加量（6%、8%、10%、12%、14%）對(duì)復(fù)合豆?jié){酒感官評(píng)分的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 白砂糖添加量對(duì)復(fù)合豆?jié){酒感官評(píng)分的影響Fig.1 Effect of sugar addition on sensory evaluation of compound soym ilk liquor

由圖1可知，當(dāng)復(fù)合豆?jié){酒中白砂糖添加量從6%增至10%時(shí)，復(fù)合豆?jié){酒的感官評(píng)分也隨之增加；當(dāng)添加量達(dá)到10%時(shí)，復(fù)合豆?jié){酒的感官評(píng)分達(dá)到最高分，為（83.3±0.7）分。但隨著白砂糖添加量的繼續(xù)增加，復(fù)合豆?jié){酒的感官評(píng)分開始呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。糖分在復(fù)合豆?jié){酒發(fā)酵過程中主要轉(zhuǎn)化為乙醇，也可以轉(zhuǎn)化成酸類、酯類、醛類等物質(zhì)[8]，復(fù)合豆?jié){酒在發(fā)酵過程中，可發(fā)酵性糖過少會(huì)出現(xiàn)酒體不豐滿、香味不足的現(xiàn)象，可發(fā)酵性糖過多則會(huì)造成酒體酸度偏大等不良現(xiàn)象。故選用白砂糖添加量為8%、10%及12%用于后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.1.2 綠豆?jié){添加量對(duì)復(fù)合豆?jié){酒感官評(píng)分的影響

控制處理?xiàng)l件為白砂糖添加量10%、釀酒酵母接種量0.3%、發(fā)酵時(shí)間6 d，考察綠豆?jié){添加量（5%、10%、15%、20%、25%）對(duì)復(fù)合豆?jié){酒感官評(píng)分的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 綠豆?jié){添加量對(duì)復(fù)合豆?jié){酒感官評(píng)分的影響Fig.2 Effect ofmung bean m ilk addition on sensory evaluation of compound soym ilk liquor

由圖2可知，綠豆?jié){的添加能顯著改善豆?jié){酒的風(fēng)味特征（P＜0.05），不僅能減弱豆?jié){酒中的豆腥味，而且能使其香氣更加豐滿。復(fù)合豆?jié){酒的感官評(píng)分隨著綠豆?jié){添加量的增加而呈現(xiàn)出先增高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)綠豆?jié){添加量為20%時(shí)，復(fù)合豆?jié){酒的感官評(píng)分達(dá)到最高，為（85.6±1.0）分。因綠豆溶出物含量較黃豆低[20，24]，故綠豆?jié){添加量過大會(huì)導(dǎo)致復(fù)合豆?jié){酒呈現(xiàn)風(fēng)味不夠飽滿的現(xiàn)象。因此，當(dāng)綠豆?jié){添加量適當(dāng)時(shí)才能賦予復(fù)合豆?jié){酒特殊的風(fēng)味及口感。由此選擇15%、20%、25%的綠豆?jié){添加量進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.1.3 釀酒酵母接種量對(duì)復(fù)合豆?jié){酒感官評(píng)分的影響

控制處理?xiàng)l件為白砂糖添加量10%、綠豆?jié){添加量20%、發(fā)酵時(shí)間6 d，考察釀酒酵母接種量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）對(duì)復(fù)合豆?jié){酒感官評(píng)分的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 釀酒酵母接種量對(duì)復(fù)合豆?jié){酒感官評(píng)分的影響Fig.3 Effect of Saccharomyces cerevisiae inoculum on sensory evaluation of compound soym ilk liquor

由圖3可知，當(dāng)釀酒酵母接種量小于0.4%時(shí)，復(fù)合豆?jié){酒的感官評(píng)分隨著釀酒酵母接種量的不斷增加而增加。當(dāng)釀酒酵母接種量為0.4%時(shí)，復(fù)合豆?jié){酒的感官評(píng)分達(dá)到最高，為（86.1±0.5）分。釀酒酵母在發(fā)酵過程中能將可發(fā)酵性糖轉(zhuǎn)化為二氧化碳和乙醇，同時(shí)還會(huì)產(chǎn)生一些醇、醛、酸、酯等香味物質(zhì)[1，12]。當(dāng)釀酒酵母接種量較低時(shí)，容易使釀酒原料不完全發(fā)酵，造成復(fù)合豆?jié){酒的酒精度偏低、酒香不突出等現(xiàn)象。當(dāng)釀酒酵母的接種量為0.3%～0.5%時(shí)，復(fù)合豆?jié){酒的感官評(píng)分雖有變化，但相互之間并無顯著性差異（P＞0.05），表明釀酒酵母接種量從0.3%繼續(xù)增加后對(duì)復(fù)合豆?jié){酒的感官特性并無顯著性影響。所以選擇釀酒酵母接種量為0.2%、0.3%、0.4%進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.1.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)復(fù)合豆?jié){酒感官評(píng)分的影響

控制處理?xiàng)l件為白砂糖添加量10%、綠豆?jié){添加量20%、釀酒酵母接種量0.3%，考察發(fā)酵時(shí)間（4 d、5 d、6 d、7 d、8 d）對(duì)復(fù)合豆?jié){酒感官評(píng)分的影響結(jié)果見圖4。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)復(fù)合豆?jié){酒感官評(píng)分的影響Fig.4 Effect of fermentation time on sensory evaluation of compound soym ilk liquor

由圖4可知，當(dāng)復(fù)合豆?jié){酒的發(fā)酵時(shí)間為7 d時(shí)，復(fù)合豆?jié){酒的感官評(píng)分最高，為（87.9±0.7）分。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間少于7 d時(shí)，因發(fā)酵醪液中可發(fā)酵性糖類還未完全被釀酒酵母所利用，酒體略顯寡淡，香味濃郁程度不高。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間超過7 d后，復(fù)合豆?jié){酒的酸度開始增大，破壞了酒體的風(fēng)味。其原因可能是當(dāng)發(fā)酵時(shí)間過長(zhǎng)時(shí)，酒精抑制了釀酒酵母的生長(zhǎng)，出現(xiàn)了菌體自溶現(xiàn)象，同時(shí)一部分乙醇被轉(zhuǎn)化為有機(jī)酸，導(dǎo)致酒體酸度增加[25]。因此，選擇發(fā)酵時(shí)間為6～8 d進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2 復(fù)合豆?jié){酒發(fā)酵工藝條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以復(fù)合豆?jié){酒的感官評(píng)分（Y）為響應(yīng)指標(biāo)，根據(jù)Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，通過Design Expert11.1.0.1軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面法試驗(yàn)，考察白砂糖添加量（A）、綠豆?jié){添加量（B）、釀酒酵母接種量（C）、發(fā)酵時(shí)間（D）4個(gè)因素對(duì)復(fù)合豆?jié){酒感官評(píng)分的影響，響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析見表3，方差分析見表4。

經(jīng)Design Expert軟件對(duì)表3的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到復(fù)合豆?jié){酒感官評(píng)分的回歸方程：

表3 復(fù)合豆?jié){酒發(fā)酵工藝條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface experiments for fermentation process optim ization of compound soym ilk liquor

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

續(xù)表

由表4可知，由Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理所得的回歸模型極為顯著（P＜0.01），且失擬項(xiàng)檢驗(yàn)不顯著（P＞0.05），表明未知因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的干擾較小，該試驗(yàn)?zāi)Ｐ湍艹浞謹(jǐn)M合試驗(yàn)數(shù)據(jù)，并可以用于確定復(fù)合豆?jié){酒釀造的最佳工藝[26-27]。4個(gè)因素對(duì)復(fù)合豆?jié){酒感官評(píng)分影響的主次順序依次為D＞A＞C＞B，即發(fā)酵時(shí)間＞白砂糖添加量＞釀酒酵母接種量＞綠豆?jié){添加量，其中一次項(xiàng)A、D和交互項(xiàng)CD對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），交互項(xiàng)AB對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05）；二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），D2對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05）；其他項(xiàng)則對(duì)結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。根據(jù)復(fù)合豆?jié){酒感官評(píng)分回歸方程得出不同因子的響應(yīng)面分析圖，結(jié)果見圖5。

圖5 各因素交互作用對(duì)復(fù)合豆?jié){酒感官評(píng)分的響應(yīng)面曲線及等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on sensory evaluation of compound soym ilk liquor

響應(yīng)面圖曲面坡度越陡峭及對(duì)應(yīng)的等高線越密集呈橢圓形表示兩因素交互影響越大[27-30]。由圖5可知，因素C與因素D之間所形成的響應(yīng)面曲面坡度在兩因素交互作用響應(yīng)面圖中最為陡峭，等高線也最為密集，即因素C與因素D之間具有最強(qiáng)的交互作用；因素A與因素B之間所形成的響應(yīng)面曲面坡度陡峭程度較CD次之。該結(jié)果與表4方差分析所得的釀酒酵母接種量與發(fā)酵時(shí)間之間具有極顯著的交互作用（P＜0.01）、白砂糖添加量與綠豆?jié){添加量之間具有顯著的交互作用（P＜0.05）的結(jié)論相吻合。

通過Design Expert軟件分析確定復(fù)合豆?jié){酒的最佳發(fā)酵工藝條件為白砂糖添加量10.82%、綠豆?jié){添加量19.06%、釀酒酵母接種量0.27%及發(fā)酵時(shí)間6.22 d，在此優(yōu)化條件下，復(fù)合豆?jié){酒感官評(píng)分的理論值為91.17分。為便于實(shí)際操作，將復(fù)合豆?jié){酒的最佳發(fā)酵工藝條件修訂為白砂糖添加量10.8%、綠豆?jié){添加量19%、接種量0.27%及發(fā)酵時(shí)間6.2 d，在此最優(yōu)發(fā)酵工藝條件下，進(jìn)行3次平行驗(yàn)證，得到復(fù)合豆?jié){酒的感官評(píng)分為（91.4±0.8）分，與其理論值基本一致。

2.3 理化指標(biāo)分析

在最佳發(fā)酵工藝條件下得到的復(fù)合豆?jié){酒其總糖含量為12.1g/L、酒精度為4.3%vol、總酸含量為7.2g/L、氨基酸態(tài)氮含量為0.24 g/L。以上4種理化指標(biāo)均符合國(guó)標(biāo)GB/T 23546—2009《奶酒》[22]的標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法對(duì)復(fù)合豆?jié){酒的發(fā)酵工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定其最優(yōu)發(fā)酵工藝條件：在黃豆?jié){中添加19.1%的綠豆?jié){、10.8%的白砂糖及0.02%的亞硫酸鈉，利用檸檬酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH為6.5，攪拌至白砂糖完全溶解，加熱至60℃，采用乳化均質(zhì)機(jī)（壓力為15MPa）均質(zhì)，均質(zhì)后在95℃條件下加熱殺菌5min；待樣品冷卻后，在無菌條件下接入0.27%經(jīng)活化后的釀酒酵母菌懸液，25℃條件下發(fā)酵6.2 d后置于4℃的冰箱中后熟24 h。此條件下可獲得色澤微黃透明、豆香與酒香和諧、酒體豐滿圓潤(rùn)的復(fù)合豆?jié){酒，其感官評(píng)分為91.4分。