新型熒光探針制備及茶葉中汞離子檢測(cè)的研究

董 哲，李 陽，鄭慶福，王 斌

（1.內(nèi)蒙古民族大學(xué) 分析測(cè)試中心，內(nèi)蒙古 通遼 028000；2.內(nèi)蒙古通遼市醫(yī)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000）

茶作為世界上最受歡迎的風(fēng)味和健康飲品，含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和多種功能性成分，具有抗氧化、抗過敏和抗病毒的作用，還能抑制各種慢性疾病[1-3]。近年來有色金屬礦產(chǎn)開發(fā)、燃煤煙氣和固體廢棄物焚燒等途徑產(chǎn)生重金屬有毒物質(zhì)增多，導(dǎo)致茶葉中劇毒的汞含量超標(biāo)風(fēng)險(xiǎn)增加。重金屬汞容易通過食物鏈不斷富集到人體中，破壞正常新陳代謝功能[4-6]。因此，準(zhǔn)確、高效地檢測(cè)茶葉中痕量Hg2+的含量，避免汞超標(biāo)變得尤為重要。傳統(tǒng)的痕量Hg2+檢測(cè)方法包括原子熒光光譜法（atomic fluorescencespectrometry，AFS）、原子吸收光譜法（atom ic absorption spectroscopy，AAS）、電感耦合等離子體-原子發(fā)射光譜法（inductivelycoupledplasmaatomic emission spectrometry，ICP-AES）等，但此類方法樣品所需的檢測(cè)設(shè)備價(jià)格高昂、操作過程復(fù)雜，單樣品成本高，一定程度上限制了其在更廣泛領(lǐng)域的應(yīng)用[7-11]。近年來，相較于有毒小分子熒光染料和量子點(diǎn)，金納米團(tuán)簇（gold nanoclusters，AuNCs）因其尺寸較小、生物相容性良好和斯托克斯位移較大，逐漸成為材料科學(xué)及生命科學(xué)中的前沿?zé)狳c(diǎn)，特別是在生物樣品分析和重金屬檢測(cè)中展示出了十分廣闊的應(yīng)用前景[12-13]。通常所合成的納米團(tuán)簇化合物穩(wěn)定性不好，甚至?xí)诙虝r(shí)間內(nèi)分解，大大限制了其在熒光探針上的實(shí)際應(yīng)用。本研究以S-亞硝基谷胱甘肽（S-nitrosoglutathione，GSNO）作為保護(hù)劑和還原劑合成了水溶性好的金納米團(tuán)簇（GSNO@AuNCs），并以此為熒光探針，建立了潛在高靈敏檢測(cè)實(shí)際茶葉樣品中Hg2+含量的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

S-亞硝基谷胱甘肽（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氯金酸（HAuCl3）（分析純）：西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；氫氧化鈉（NaOH）（分析純）、硼氫化鈉（NaBH4）（分析純）：長(zhǎng)春鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司；氯化鈉（NaCl）、氯化銅（CuCl2）、氯化鉛（PbCl2）、氯化鎂（MgCl2）、氯化鎳（NiCl2）、氯化鈣（CaCl2）、氯化鋅（ZnCl2）、氯化錳（MnCl2）、氯化鎘（CdCl2）、氯化鋇（BaCl2）、氯化鋁（AlCl3）、氯化鉻（CrCl3）、氯化鐵（FeCl3）等化學(xué)試劑（均為分析純）：天津市化學(xué)試劑三廠。透析袋（截留分子質(zhì)量8000～10000Da）：上海易佰聚經(jīng)貿(mào)有限公司；茶葉樣品：當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

JEM-2100F場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡：日本電子株式會(huì)社；970CRT熒光分光光度計(jì)：上海精科儀器儀表有限公司；8453UV-VIS紫外可見分光光度計(jì)：美國安捷倫科技公司；ZetasizerNano ZS90納米粒徑電位分析儀：英國馬爾文儀器有限公司；RH-Basic加熱磁力攪拌器：德國艾卡儀器設(shè)備有限公司；MARS6微波消解儀：美國培安科技公司；M illi-Q超純水系統(tǒng)：密理博中國有限公司。

1.3 方法

1.3.1 S-亞硝基谷胱甘肽包被的金納米團(tuán)簇的合成

根據(jù)GUO C等[14-16]的研究，將215 μL 10 mmol/L的HAuC14溶液中逐滴加入2.5m L 2mmol/L的GSNO溶液中，加入105μL 1mmol/L的NaOH溶液，并劇烈攪拌30min后，再逐滴加入25μL 12mmol/L的硼氫化鈉溶液，混合物在室溫環(huán)境下繼續(xù)攪拌5h。將所得淡褐色水溶液，轉(zhuǎn)移至截留分子質(zhì)量為8 000～10 000Da透析袋中，于2 000m L超純水中透析24 h，每4 h更換透析容器中的蒸餾水以便去除小分子雜質(zhì)。所制備的S-亞硝基谷胱甘肽包被的金納米團(tuán)簇（GSNO@AuNCs）用錫箔紙包好置于4℃冰箱中備用。

1.3.2 不同檢測(cè)條件對(duì)GSNO@AuNCs熒光性能的影響

樣品的熒光強(qiáng)度值（F）的測(cè)定時(shí)，其熒光光譜儀激發(fā)波長(zhǎng)為370nm，掃描范圍550～800nm，狹縫寬度均設(shè)為5nm，每個(gè)濃度平行測(cè)定3次。為了考察不同pH值對(duì)檢測(cè)時(shí)熒光性能的影響，分別取定量的GSNO@AuNCs溶液，并分別調(diào)節(jié)體系pH值至（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0），混勻后靜置10m in轉(zhuǎn)移到石英比色皿中測(cè)試樣品的熒光強(qiáng)度。為了考察體系鹽濃度對(duì)檢測(cè)時(shí)熒光性能的影響，分別取定量的GSNO@AuNCs溶液，并分別調(diào)節(jié)體系的NaCl濃度至（0、0.01mmol/L、0.1mmol/L、1.0mmol/L、10mmol/L、100mmol/L和200mmol/L），均混勻后靜置10m in轉(zhuǎn)移到石英比色皿中測(cè)試樣品的熒光強(qiáng)度。為了考察不同混勻時(shí)間對(duì)檢測(cè)時(shí)熒光性能的影響，分別取定量的GSNO@AuNCs溶液，混搖后靜置至（0、5min、10min、15min、20min、25min和30m in）后，轉(zhuǎn)移到石英比色皿中測(cè)試樣品的熒光強(qiáng)度。為了考察不同溫度對(duì)檢測(cè)時(shí)熒光性能的影響，在不同反應(yīng)溫度條件下（5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃），分別取定量的GSNO@AuNCs溶液，均混搖后靜置10m in轉(zhuǎn)移到石英比色皿中測(cè)試樣品的熒光強(qiáng)度。

1.3.3 GSNO@AuNCs對(duì)Hg2+熒光檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

在室溫（25℃）條件下測(cè)量樣品的熒光強(qiáng)度值（F）時(shí)，熒光光譜儀激發(fā)波長(zhǎng)為370 nm，掃描范圍550～800 nm，狹縫寬度均設(shè)為5 nm，每個(gè)濃度平行測(cè)定3次。取100μL的GSNO@AuNCs溶液，向其中加入200μL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）（pH 7.0），分別加入一系列100μL不同濃度Hg2+溶液，再向其加入適量的蒸餾水定容至1m L后混搖均勻，靜置10min，轉(zhuǎn)移到石英比色皿中掃描樣品。最低檢測(cè)限（limitof detection，LOD）是通過計(jì)算平行測(cè)定6次的空白樣品標(biāo)準(zhǔn)差的3倍得到的（3σ）[17]。

1.3.4 精密度及加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

按上述步驟，測(cè)試每份樣品的熒光強(qiáng)度后，復(fù)測(cè)5次，取其6次實(shí)驗(yàn)的平均值（average）計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)偏差（standard deviation，SD）和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），以此結(jié)果來判定該方法的精密度。樣品加標(biāo)回收是指取相同兩組試樣，其中一組加入確定含量的待測(cè)成分的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，兩組同一時(shí)間按相同的實(shí)驗(yàn)步驟測(cè)定熒光強(qiáng)度。加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的一組所對(duì)應(yīng)值減去未加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)一組所對(duì)應(yīng)值的做差值后，與加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的含量的比值，為樣品加標(biāo)回收率，其計(jì)算公式如下：

1.3.5 干擾金屬離子對(duì)GSNO@AuNCs檢測(cè)Hg2+影響

在室溫（25℃）條件下，取兩組100μL所配制的1mol/L各 離 子（Na+、Cu2+、Pb2+、Mg2+、Ni2+、Ca2+、Zn2+、Mn2+、Cd2+、Ba2+、Al3+、Cr3+、Fe3+）溶液，均加入100 μL的GSNO@AuNCs溶液，均向其中加入200μLPBS緩沖溶液（pH 7.0），其中一組加入100μL的0.1mol/L的Hg2+溶液，兩組再加入適量的蒸餾水，分別定容至1m L后混勻，靜置10min，轉(zhuǎn)移到石英比色皿中測(cè)定這兩組樣品的熒光強(qiáng)度。

1.3.6 GSNO@AuNCs對(duì)實(shí)際茶葉樣品中的Hg2+檢測(cè)

稱取0.200 0 g干燥過的茶葉樣品于聚四氟乙烯（polytetrafluoroethylene，PTFE）高壓消解罐中，加入5.0m L濃硝酸及1.5m L過氧化氫，放入微波消解儀內(nèi)進(jìn)行消解，結(jié)束后轉(zhuǎn)移至石墨爐電熱趕酸儀于120℃條件下趕酸。30min后將樣品離心（10 000 r/m in），并通過0.22μm微孔濾膜過濾以消除可能的干擾因素，用適量蒸餾水定容至100m L[18-19]。取100μL上述所配制的茶葉消解溶液，加入100μL的GSNO@AuNCs溶液，向其中加入200μLPBS緩沖溶液（pH 7.0），再向其中加入適量的蒸餾水定容至1m L后混勻，靜置10min，轉(zhuǎn)移到石英比色皿中掃描樣品。

2 結(jié)果與分析

2.1 GSNO@Au NCs的表征

采用高倍透射電子顯微鏡和動(dòng)態(tài)光散射儀表征GSNO@AuNCs，結(jié)果見圖1。

圖1 GSNO@AuNCs的透射電鏡圖（A）納米粒子尺寸分布（B）Fig.1 Transm ission electron m icroscopy(A)and the nano particle size distributions(B)of GSNO@AuNCs

由圖1A可知，所合成的GSNO@AuNC平均粒徑在2.5nm左右，顆粒呈球形并且分散性較好；由圖1B可知，GSNO@AuNCs的粒徑呈正態(tài)分布，其中粒徑為1.5 nm的顆粒最多。

采用紫外-可見吸收光譜和熒光光譜表征GSNO@Au NCs，結(jié)果見圖2。

圖2 GSNO@AuNCs的紫外吸收光譜圖（a）、激發(fā)光譜（b）和發(fā)射光譜（c）Fig.2 Ultraviolet-visible spectrophotometer(a),excitation spectrum(b)and em ission spectrum(c)of GSNO@AuNCs

由圖2可知，a曲線表明了紫外可見吸收光譜峰的位置在波長(zhǎng)約360 nm處，可歸屬為樣品所獨(dú)有的量子限域效應(yīng)；而在波長(zhǎng)400～600 nm處無特征吸收峰，則表明樣品沒有形成較大的納米顆粒而形成了納米團(tuán)簇。隨后測(cè)量了GSNO@AuNCs的最大激發(fā)光譜（b）和最大發(fā)射光譜（c），其最大激發(fā)波長(zhǎng)為370 nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為635 nm。

2.2 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

按1.3.2方法考察了pH值、鹽離子濃度、反應(yīng)時(shí)間和溫度對(duì)GSNO@Au NCs體系熒光猝滅的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 pH值（A）、鹽離子濃度（B）、反應(yīng)時(shí)間（C）和溫度（D）對(duì)GSNO@AuNCs的熒光強(qiáng)度影響Fig.3 Effect of pH(A),NaCl concentration(B),reaction time(C)and temperature(D)on fluorescence intensity of GSNO@AuNCs

由圖3A可知，在pH值在3.0～11.0范圍內(nèi)對(duì)GSNO@Au NCs熒光強(qiáng)度影響微不足道。考慮到檢測(cè)對(duì)象Hg2+在堿性環(huán)境下可能會(huì)形成絮狀沉淀，已經(jīng)實(shí)際檢測(cè)時(shí)的便利性，確定pH值為7.0。由圖3B可知，當(dāng)體系中的鹽離子（NaCl）濃度在0～200mmol/L時(shí)，不會(huì)對(duì)體系熒光強(qiáng)度造成明顯影響。因此為了實(shí)際檢測(cè)的簡(jiǎn)便性，確定在檢測(cè)過程中不額外添加鹽離子；由圖3C可知，GSNO@Au NCs的熒光強(qiáng)度隨著反應(yīng)時(shí)間的增加而增加，10min后已趨于平衡，因此確定反應(yīng)時(shí)間為10min；由圖3D可知，隨著溫度在5～45℃范圍內(nèi)升高，金納米團(tuán)簇的熒光強(qiáng)度逐漸降低，可能是介質(zhì)水的黏度降低，提高了熒光分子與水分子發(fā)生碰撞熒光淬滅的幾率，考慮到為更貼近實(shí)際樣品的檢測(cè)，確定檢測(cè)溫度為室溫25℃。結(jié)果表明，本方法所制備的熒光探針穩(wěn)定性較好，對(duì)Hg2+的檢測(cè)抗干擾能力較強(qiáng)。

2.3 Hg2+的熒光檢測(cè)法的標(biāo)準(zhǔn)曲線建立及檢出限

采用1.3.3的方法，GSNO@AuNC對(duì)不同濃度的Hg2+進(jìn)行了定量檢測(cè)，結(jié)果見圖4。

圖4 不同濃度的Hg2+對(duì)GSNO@AuNCs作用后的熒光光譜（A）及Hg2+與GSNO@AuNCs的熒光猝滅的線性關(guān)系（B）Fig.4 Fluorescence spectra of GSNO@AuNCs after different Hg2+concentrations reaction(A),and linear relationship of the fluorescence quenching of GSNO@AuNCs with Hg2+

由圖4A可知，不同濃度的Hg2+對(duì)GSNO@Au NCs作用后的熒光光譜可知，GSNO@AuNC在635 nm處的熒光強(qiáng)度隨著Hg2+濃度的增加而減小，這是由于Hg2+與金納米團(tuán)簇發(fā)生了特異性聚集作用導(dǎo)致熒光猝滅。由圖4B可知，汞離子溶液濃度（X）與GSNO@AuNC熒光強(qiáng)度的差值（Y）在0.1～40μmol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性方程為Y=1.392+27.28X，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 5。采用1.3.4的方法測(cè)得Hg2+的理論最低檢測(cè)限為0.033μmol/L。

2.4 金屬離子對(duì)GSNO@Au NCs檢測(cè)Hg2+干擾實(shí)驗(yàn)

為了考察GSNO@Au NCs對(duì)Hg2+檢測(cè)的抗干擾性，對(duì)可能存在的干擾金屬離子進(jìn)行干擾性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖5。

圖5 共存金屬離子對(duì)Hg2+測(cè)定的影響Fig.5 Effect of the co-exiting metal ions on detection of Hg2+

由圖5可知，與Hg2+相比所加入的這些金屬離子未能引起體系明顯的熒光猝滅效應(yīng)，證實(shí)了本方法中GSNO@Au NCs作為熒光探針對(duì)Hg2+具有選擇性。

2.5 精密度及加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)[20]

為了評(píng)估GSNO@AuNC檢測(cè)Hg2+的實(shí)用性，選取市售常見紅茶、綠茶、茉莉花茶和普洱茶四類樣本進(jìn)行了精密度及加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表1。

表1 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of adding standard recovery experiment

結(jié)果表明，加標(biāo)回收率為98.5%～105.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.6%～8.5%，表明該檢測(cè)方法的精密度及準(zhǔn)確度良好。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過S-亞硝基谷胱甘肽作為保護(hù)劑和還原劑，合成了穩(wěn)定性高和熒光強(qiáng)度良好的水溶性金納米團(tuán)簇GSNO@AuNC。在最佳優(yōu)化條件下（25℃，pH 7.0，反應(yīng)時(shí)間為10min），GSNO@AuNCs能有效地使Hg2+的熒光強(qiáng)度猝滅，而且不受Na+、Cu2+、Pb2+、Mg2+、Ni2+、Ca2+、Zn2+、Mn2+、Cd2+、Ba2+、Al3+、Cr3+、Fe3+等離子干擾。汞離子濃度在0.1～40.0μmol/L范圍內(nèi)與GSNO@AuNCs的熒光強(qiáng)度呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為Y=1.392+27.28X，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 5，檢出限為0.033μmol/L。在實(shí)際茶葉樣品中汞離子檢測(cè)中加標(biāo)回收率為98.5%～105.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.6%～8.5%，證明該檢測(cè)方法有良好的精密度及可靠性。研究成功建立了快速靈敏檢測(cè)茶葉中汞含量的方法，具有一定的發(fā)展前景和推廣價(jià)值。