移碼突變L442Cfs*8導致的凝血因子XI缺陷癥家系表型及基因型分析

朱光俊 張欽怡 蘇正仙 金先富 張慧斐 畢曉潔

遺傳性凝血因子XI（FXI）缺陷癥為罕見的常染色體隱性遺傳病，于1953年首次被Rosenthal等[1]報道，目前，突變類型已超過 200 多種（http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/gene.php?gene=F11），國外統(tǒng)計其發(fā)病率為 1/500000～1/1000000，且存在種族差異[2]。目前我國對于遺傳性FXI缺陷癥的報道較少，具體的致病機制也不是很明確。筆者對1例遺傳性FXI缺陷癥進行表型和基因型研究，研究其分子致病機制，現(xiàn)報道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 該家系共5人，包括先證者及父親、兒子、妻子，家系譜見圖1。先證者，男，32歲。因“反復牙齦出血”于2018年3月5日來我院檢查。實驗室常規(guī)凝血功能檢查發(fā)現(xiàn)：活化部分凝血活酶時間（APTT）顯著延長，F(xiàn)XI活性（FXI:C）極低，D-二聚體輕度增高，其余指標均在正常參考范圍內(nèi)。先證者肝腎功能正常，未使用抗凝藥物。先證者父親偶有痔瘡出血，父母非近親結(jié)婚，其他家系成員均無自發(fā)出血或血栓形成病史。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑 儀器：STA-R MAX全自動血凝儀（法國STAGO公司）、全自動生化分析儀AU5830（美國雅培公司）、PCR擴增儀ABI Thermal cycler 2720（美國ABI公司）、核酸蛋白分析儀（美國Beckman公司）、電泳儀（美國Bio-rad公司）、凝膠成像系統(tǒng)（上海天能公司）。試劑：凝血項目檢測試劑盒（法國STAGO公司）、DNA提取試劑盒、抗原檢測試劑盒、PCR擴增試劑盒（上海西塘生物科技技術(shù)公司）。

圖1 遺傳性凝血性因子XI缺陷血癥家系圖

1.2.2 引物 引物序列參考文獻[3] ，由華大基因生物公司合成。

1.2.3 標本采集和處理 采集所有受試者外周血2.7ml，用 0.109mol/L 枸櫞酸鈉 1∶9 抗凝，3 000 r/min 離心10 min。上層乏血小板血漿用于凝血項目檢測；下層血細胞用于提取DNA（血樣），提取完成后放置于-20℃冰箱保存待用。

1.2.4 凝血項目檢測 在全自動血凝分析儀上采用一期凝固法檢測PT、APTT、FIB、TT、凝血因子Ⅱ活性（FⅡ：C）、凝血因子 V 活性（FV：C）、凝血因子Ⅶ活性（FⅦ：C）、凝血因子Ⅷ活性（FⅧ：C）、凝血因子Ⅸ活性（FⅪ：C）、凝血因子 X 活性（FX：C）、FXI活性（FⅪ：C）及凝血因子Ⅻ活性（FⅫ：C）；免疫比濁法檢測纖維蛋白（原）降解產(chǎn)物（FDP）、D-二聚體；采用ELISA法檢測FⅪ抗原（FⅪ：Ag）含量。

1.2.5 基因測序 使用DNA提取試劑盒提取所有成員外周血基因組DNA，經(jīng)PCR擴增后外送上海華大基因檢測公司進行測序，測序結(jié)果采用Chromas軟件與美國NCBI基因庫（GenBank）所公布的基因序列進行比對，發(fā)現(xiàn)突變后進行反向測序予以證實。

1.2.6生物學信息軟件分析采用Mutation Taster（http://www.mutationtaster.org）、PolyPhen-2（http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2）和 SIFT（http://sift.jcvi.org）3 個在線生物信息軟件，通過評分預測突變位點對蛋白質(zhì)功能的影響。

2 結(jié)果

2.1 先證者以及家系成員凝血功能檢測結(jié)果 見表1。

表1 先證者及家系成員凝血指標檢測結(jié)果

2.2 基因分析結(jié)果 先證者F11的11號外顯子存在L442Cfs*8雜合突變。先證者父親在該位點的測序結(jié)果與先證者一致，除此以外所有其它的基因測序結(jié)果都顯示為正常。見圖2、3。

圖2 先證者及父親F11基因11號外顯子L442Cfs*8突變

圖3 F11基因11號外顯子野生基因型

2.3 生物學信息軟件分析結(jié)果 PolyPhen-2評分結(jié)果為1.00分，預示突變?yōu)橛泻ν蛔?；Mutation Taster評分結(jié)果為disease causing，預示此突變可引起疾??；SIFT評分結(jié)果為0.10分，預示此突變引起蛋白質(zhì)功能改變。

3 討論

FXI是一種絲氨酸蛋白酶原，在血漿中它主要與高分子量激肽原（HWMK）結(jié)合形成復合物[4]。編碼FXI的基因F11位于4q35，共含有15個外顯子和14個內(nèi)含子，全長23kb[5]，l號外顯子編碼的是5′端非轉(zhuǎn)錄區(qū)，2號外顯子編碼前導肽鏈，3-15號外顯子共編碼607個氨基酸分子，形成的FXI包括含有4個Apple結(jié)構(gòu)域的重鏈以及一個胰蛋白酶楊絲氨酸蛋白酶催化區(qū)（SP）的輕鏈。成熟的FXI分子含有兩個相同單體，由兩個殘基Cys321形成二硫鍵組成[6]。

FXI在內(nèi)源性凝血途徑發(fā)揮重要作用，通過一系列的凝血因子逐級活化過程，最終激活纖維蛋白原，形成纖維蛋白網(wǎng)，使血小板形成的團塊更加牢固[4,7]。遺傳性FXI缺陷癥臨床表現(xiàn)多樣，突變基因雜合子為正常的30%～70%，而純合子的血漿FXI水平僅為正常的0～20%[8]，該病患者無性別差異，且一般無自發(fā)性出血[9]，因此疾病的診斷和治療都存在多變性。推測原因是FXI參與凝血過程的放大階段而不是影響凝血的起始階段，并且活化的血小板顆粒含有FXI，總活性得到一定的補償，因此FXI缺陷的患者多數(shù)是在手術(shù)、創(chuàng)傷后才會表現(xiàn)出止凝血障礙[10]。出血的嚴重程度常與累及的組織部位有關(guān)，原因是FXI可促進凝血酶激活的纖溶抑制物（TAFI）的產(chǎn)生，從而可以穩(wěn)定已經(jīng)形成的凝血塊在纖溶活性高的部位更容易出血，常見于口腔黏膜[11]。

本文中先證者APTT為92.9s，查FXI活性2%，凝血因子抗原3.6%，活性與抗原成等比例下降，呈交叉反應(yīng)物質(zhì)陰性特點?；驕y序結(jié)果顯示，先證者F11的11號外顯子存在L442Cfs*8雜合突變，其父親同樣攜帶該突變基因，可以診斷為遺傳性FXI缺陷癥。根據(jù)Mutation Taster分析顯示，L442Cfs*8屬于移碼突變，突變位點編碼的亮氨酸（Leu）變成半胱氨酸（Cys），并且其相對應(yīng)的mRNA在突變位點之后的第8個密碼子變成終止密碼，使得編碼氨基酸翻譯提前終止，形成截斷蛋白，分子鏈變短，結(jié)構(gòu)完整性受到影響，因此突變后FXI抗原和活性均下降。另外兩個生物信息學軟件均指出L442Cfs*8雜合突變會導致蛋白質(zhì)的功能發(fā)生改變，與疾病有關(guān)。同時，L442位于輕鏈的絲氨酸蛋白酶催化區(qū)，Leu突變成Cys后蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，F(xiàn)XI酶原活化的過程同時受到抑制。本文中先證者與其父親攜帶相同的突變基因，但先證者FXI活性和抗原均明顯降低，且出現(xiàn)反復自發(fā)性牙齦出血，而其父親卻僅有偶發(fā)痔瘡出血，推測其原因是，先證者8號外顯子同時存在c.935A＞C多態(tài)性，導致K312T突變，根據(jù)Mutation Taster分析，8號外顯子編碼FXI的A3結(jié)構(gòu)域，是FXI的重要結(jié)合部位[12]，該多態(tài)性會造成蛋白質(zhì)的功能發(fā)生改變，具體機制還有待進一步研究。

綜上所述，該遺傳性凝血因子XI缺陷癥家系先證者及其父親F11基因11號外顯子均攜帶有L442Cfs*8雜合突變，此突變是導致患者FXI：C明顯下降的主要原因。但具體作用機制尚有待于更進一步體外表達實驗加以證實。