黃瓜生產(chǎn)過程中致病菌調(diào)查及耐藥性分析

鄔元娟 張露月 王文博 郭棟梁 郝艷芳 劉磊

摘要 對黃瓜生產(chǎn)過程中黃瓜、土壤、基肥、灌溉用水及植株中感染沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、單增李斯特氏菌的情況進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果表明，共計102批次樣本中黃瓜樣品、植株及土壤中各檢出一株大腸桿菌，植株中檢出一株金黃色葡萄球菌。對大腸桿菌及金黃色葡萄球菌進(jìn)行8大類13種抗生素的藥敏試驗，結(jié)果表明，土壤中大腸桿菌為敏感菌株且對13種抗生素均敏感，植株中大腸桿菌僅對氨曲南耐藥，黃瓜中大腸桿菌對氨芐西林、哌拉西林、氯霉素和四環(huán)素耐藥，為多重耐藥菌株;植株中金黃色葡萄球菌對青霉素、紅霉素、克林霉素及磺胺甲噁唑耐藥，為多重耐藥菌株。

關(guān)鍵詞 黃瓜;大腸桿菌;金黃色葡萄球菌;耐藥性

中圖分類號 S41-30文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）14-0207-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.14.061

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Abstract Cucumber， soil， base fertilizer， irrigation water and plant infected with Salmonella， Staphylococcus aureus， Escherichia coli and Listeria monocytogenes during the production of cucumber were investigated.The results showed that among the 102 tested samples， Escherichia coli was detected in one ripe cucumber， one cucumber plant and one cultivated soil sample respectively，and Staphylococcus aureus was found in one cucumber plant sample.The susceptibility test of 8 major classes of 13 types of antibiotics against Escherichia coli and Staphylococcus aureus showed that the Escherichia coli in cultivated soil was sensitive strains， which was susceptible to the 13 types of antibiotics.Escherichia coli in cucumber plants was resistant to aztreonam only; Escherichia coli in ripe cucumber was resistant to ampicillin， piperacillin， chloramphenicol and tetracycline， making ripe cucumber multidrugresistant strains.Staphylococcus aureus in cucumber plants was resistant to penicillin， erythromycin， clindamycin and sulfamethoxazole， which made cucumber plants multidrugresistant strains.

Key words Cucumber;Escherichia coli;Staphylococcus aureus;Drug resistance

作者簡介 鄔元娟（1977—），女，河南光山人，研究員，碩士，從事農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與檢測技術(shù)研究。*通信作者：王文博，研究員，碩士，從事農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與檢測技術(shù)研究;郭棟梁，副研究員，從事農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與檢測技術(shù)研究。

收稿日期 2019-01-23

即食生鮮蔬菜屬于低酸性食品，具有較高的含水量，又可以提供必需的維生素等營養(yǎng)，是餐桌上必不可少的即食食品 ，但為了防止維生素等營養(yǎng)的流失，消費者在食用時往往不烹調(diào)，在簡單的清洗后直接食用[1]。在我國，隨著健康飲食理念的引導(dǎo)，生食新鮮蔬菜的需求日益增多，但由于缺少加熱過程，極易招致病源微生物的侵染，特別是食源性致病菌污染，嚴(yán)重危害人類健康[2]。近年國外暴發(fā)多起即食生鮮蔬菜食源性致病菌中毒事件， 例如 2006 年美國暴發(fā)的菠菜被沙門氏菌污染造成205 人被感染，導(dǎo)致3 人死亡[3]; 2011年德國暴發(fā)出血性大腸桿菌感染，所引起的毒黃瓜中毒事件，最終導(dǎo)致14 人死亡[1]。自抗生素被人類發(fā)現(xiàn)以來，抗生素給臨床治療帶來了前所未有的重大突破，但隨著抗生素的頻繁大量使用，細(xì)菌對抗生素的耐藥性越來越廣泛[4]。據(jù)美國疾病預(yù)防控制中心統(tǒng)計，美國在2013 年因多重耐藥菌株所引發(fā)的人群感染高達(dá) 200 萬人，最終導(dǎo)致 23 000 人死亡[5]。據(jù)有關(guān)報道，中國使用抗生素的總量是英國使用量的 150 倍，人均日常使用量是美國使用量的 6 倍以上[4，6]。 抗生素的大量使用已經(jīng)導(dǎo)致食源性致病菌耐藥性日益嚴(yán)重，并產(chǎn)生多重耐藥性。

黃瓜的熱量非常低，對于高血壓、高血脂以及糖尿病等患者是一種非常理想的食療蔬菜。黃瓜既可生吃也可涼拌，因此深受廣大消費者的喜愛。由于黃瓜營養(yǎng)豐富，在座果成熟期間常被昆蟲叮咬和鳥類啄食，從而會感染各種微生物使其存在被食源性致病微生物污染的可能。黃瓜生長速度非?？欤瑤滋靸?nèi)即可成熟采食，因此在黃瓜生產(chǎn)過程中，土壤、基肥、灌溉用水等環(huán)境因素對黃瓜影響非常大，因此對其進(jìn)行食源性致病微生物風(fēng)險篩查驗證評估，可以初步摸清其病原微生物的種類以及危害程度，為生產(chǎn)指導(dǎo)、科學(xué)監(jiān)管及消費引導(dǎo)提供技術(shù)依據(jù)。該研究選取露天和大棚栽培中黃瓜、植株、基肥、灌溉用水及土壤共計102批次樣本，對黃瓜中沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、單增李斯特氏菌等食源性致病菌風(fēng)險篩查驗證評估，并對檢測出的食源性致病菌抗生素進(jìn)行藥敏試驗， 以期為選擇有效抗菌藥、防止抗生素的濫用及研究致病菌提供可靠依據(jù)，也為完善即食蔬菜致病菌防治體系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

選取露天和大棚栽培中黃瓜、植株、基肥、灌溉用水及土壤共計102批次樣本。其中露天栽培中黃瓜（10）、植株（12）、基肥（5）、灌溉用水（13）及土壤（13），共計53批次樣本;大棚栽培中黃瓜（12）、植株（8）、基肥（5）、灌溉用水（12）及土壤（12），共計49批次樣本。每份黃瓜樣品采集量為500～1 000 g，植株樣品采集量為500～1 000 g，灌溉用水樣品采集量為500 mL，基肥樣品采集量為1 000 g（5點隨機(jī)采樣），土壤樣品采集量為1 000 g（5點隨機(jī)采樣），無菌袋封裝。保存、運(yùn)輸溫度為冷藏，4 h 內(nèi)送達(dá)實驗室進(jìn)行檢驗。采樣過程中遵循無菌操作程序，防止一切可能的外來污染。

1.2 主要試劑及設(shè)備

沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、空腸彎曲桿菌所用增菌液、分離培養(yǎng)基及顯色培養(yǎng)基均購自廣東環(huán)凱生物科技有限公司;所有試劑及生化檢定卡均在有效期內(nèi)使用;生化培養(yǎng)箱購自上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;質(zhì)控菌株均由廣東省食品微生物安全工程技術(shù)研究開發(fā)中心提供，質(zhì)控菌株編號分別為沙門氏菌FSCC215003、金黃色葡萄球菌FSCC223005、大腸桿菌ATCC25922、單增李斯特菌CMCC4002。

1.3 檢測方法 金黃色葡萄球菌參照《食品微生物學(xué)檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗（第二法）》 （GB 4789.10—2010）[7]進(jìn)行檢測，沙門氏菌參照《食品微生物學(xué)檢驗 沙門氏菌檢驗》 （GB 4789.4—2010）[8]進(jìn)行檢測，單增李斯特菌參照《食品微生物學(xué)檢驗 單核細(xì)胞增生李斯特菌檢驗》（GB 4789.30—2010）[9]進(jìn)行檢測，大腸桿菌參照《食品微生物學(xué)檢驗 大腸埃希氏菌檢驗》（GB 4789.6—2016）[10]進(jìn)行檢測。檢測過程中嚴(yán)格按照《國家食源性致病菌監(jiān)測工作手冊》中質(zhì)量控制操作程序進(jìn)行，并以標(biāo)準(zhǔn)菌株為對照菌株進(jìn)行質(zhì)控。

1.4 藥敏試驗方法

將保存于-80 ℃冰箱的大腸桿菌取出復(fù)蘇，劃線接種于營養(yǎng)瓊脂板上，挑取菌落數(shù)個置于接種水（DEMINERALIZED WATER）中，用0.5麥?zhǔn)媳葷峁鼙葷?取上述菌液60 μL，加入營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液中，混勻;吸取稀釋菌液，加入藥敏板中，毎孔100 μL;將板條放入恒溫培養(yǎng)箱中36 ℃培養(yǎng)16～24 h，自培養(yǎng)箱中取出板條，判斷各個孔的陰陽性結(jié)果。

1.4.1 大腸桿菌藥敏板濃度。

頭孢噻呋（EFT）0.125～8.000 μg/mL、青霉素（PEN）0.125～8.000 μg/mL、氨芐西林（AM）4～16 μg/mL、阿莫西林-克拉維酸（AMC）4/2～16/8 μg/mL、頭孢西丁（FOX）1～16 μg/mL、苯唑西林（OX）0.125～8.000 μg/mL、氨曲南（AZT）2～16 μg/mL、美羅培南（EMP）1～8 μg/mL 、哌拉西林（PIP）4～64 μg/mL、慶大霉素（GEN）2～8 μg/mL、鏈霉素（STS）1 000 μg/mL、卡那霉素（KAN）4～16 μg/mL、四環(huán)素（TET）2～8 μg/mL、復(fù)方新諾明（T/S）0.5/9.5～2/38 μg/mL、氧氟沙星（OFX）1～8 μg/mL、環(huán)丙沙星（CFX）0.5～2.0 μg/mL、克林霉素（CLN）0.125～4.000 μg/mL、氯霉素（CLM）4～16 μg/mL、利福平（RIF）0.25～16.00 μg/mL、氟苯尼考（FFC）0.5～32.0 μg/mL 、阿奇霉素（AZM）2～64 μg/mL，上海星佰生物技術(shù)有限公司。

1.4.2 金黃色葡萄球菌藥敏板濃度。

頭孢噻呋（EFT）0.125～32.000 μg/mL、青霉素（PEN）0.06～0.12 μg/mL、氨芐西林（AM）0.125～2.000 μg/mL、苯唑西林（OX）0.125～8.000 μg/mL、四環(huán)素（TET）0.125～32.000 μg/mL、復(fù)方新諾明（T/S）0.5/9.5～4/76 μg/mL、環(huán)丙沙星（CFX）0.06～16.000 μg/mL、克林霉素（CLN）0.06～32.00 μg/mL、紅霉素0.125～16.000 μg/mL、磺胺甲噁唑16～512 μg/mL、替米考星0.5～64.0 μg/mL、萬古霉素0.25～32.00 μg/mL，上海星佰生物技術(shù)有限公司。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜生產(chǎn)過程中食源性致病菌檢出總體情況 該項研究共分離純化得到大腸桿菌 3株、金黃色葡萄球菌 1株。其中座果前期采集的黃瓜樣品、座果前期采集的植株樣品中各檢出一株大腸桿菌及座果后期采集的土壤樣品檢出一株大腸桿菌;座果前期采集的植株樣品中檢出一株金黃色葡萄球菌。

2.2 大腸桿菌藥物敏感性試驗結(jié)果分析與最低抑菌濃度（MIC）值 采用CLSI M100S 26th Edtion 抗微生物藥物敏感性試驗的執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)對大腸桿菌進(jìn)行耐藥性討論。

2.2.1 大腸桿菌藥敏試驗結(jié)果。采用目前國際通用的美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會（CLSI）2016年標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的微量肉湯稀釋法和結(jié)果判定方法，對分離得到的3株大腸桿菌進(jìn)行藥敏試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表1），氟苯尼考MIC值為4～>32 μg/mL，利福平MIC值為4～16 μg/mL，頭孢噻呋MIC值為0.25～0.50 μg/mL，青霉素和苯唑西林的MIC值均大于8 μg/mL，氨芐西林的MIC值為≤4～>16 μg/mL，克林霉素MIC值>4 μg/mL，阿奇霉素MIC值為4～8 μg/mL，頭孢西丁MIC值為≤1～8 μg/mL，鏈霉素MIC值為≤1 000 μg/mL，奧格門丁MIC值為≤4/2～16/8 μg/mL，復(fù)方新諾明MIC值為≤0.5/9.5～>2/38 μg/mL，哌拉西林MIC值為≤4～>64 μg/mL，環(huán)丙沙星MIC值≤0.5 μg/mL，氨曲南MIC值為≤2～>16 μg/mL，美羅培南和氧氟沙星的MIC值≤1 μg/mL，氯霉素MIC值分布為≤4～>16 μg/mL，卡那霉素MIC值≤4 μg/mL，慶大霉素MIC值≤2 μg/mL，四環(huán)素MIC值分布為≤2～>8 μg/mL。

2.2.2 大腸桿菌耐藥性情況。CLSI M100S 26th Edtion標(biāo)準(zhǔn)中沒有利福平（RIF），青霉素（PEN）、苯唑西林（OX）、克林霉素（CLN）、阿奇霉素（AZM）、氟苯尼考（STS）、鏈霉素（STS）等藥物對革蘭氏陰性菌的耐藥性判定標(biāo)準(zhǔn)無法對其結(jié)果做出有效的耐藥性分析，結(jié)果表明青霉素（PEN）0.125～8.000 μg/mL、苯唑西林（OX）0.125～8.000 μg/mL、克林霉素（CLN）0.125～4.000 μg/mL、克林霉素（CLN）≤1 000 μg/mL濃度下無法對大腸桿菌形成有效抑制，利福平16 μg/mL濃度下可以對100%的大腸桿菌實現(xiàn)形成抑制，阿奇霉素8 μg/mL 濃度下可以對100%的大腸桿菌形成有效抑制，氟苯尼考8 μg/mL 濃度下可以對66.7%的大腸桿菌形成有效抑制。

采用CLSI? M100S 26th Edtion標(biāo)準(zhǔn)對此次藥物敏感性試驗進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氨芐西林（AM）、奧格門?。ˋMC）、頭孢西?。‵OX）、氨曲南（AZT）、美羅培南（EMP）、哌拉西林（PIP）、慶大霉素（GEN）、卡那霉素（KAN）、四環(huán)素（TET）、復(fù)方新諾明（T/S）、氧氟沙星（OFX）、環(huán)丙沙星（CFX）、氯霉素（CLM）共13種抗生素均可對大腸桿菌形成有效抑制，其中土壤中大腸桿菌為敏感菌株且對13種抗生素均耐藥;植株中大腸桿菌僅對氨曲南耐藥;黃瓜中大腸桿菌對氨芐西林、哌拉西林、氯霉素和四環(huán)素耐藥，為多重耐藥菌株。

2.3 金黃色葡萄球菌藥物敏感性試驗結(jié)果分析與MIC值 采用CLSI M100S 26th Edtion 抗微生物藥物敏感性試驗的執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)對金黃色葡萄球菌進(jìn)行耐藥性討論。

2.3.1 金黃色葡萄球菌藥敏試驗結(jié)果。采用目前國際通用的美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會（CLSI）2016年標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的微量肉湯稀釋法和結(jié)果判定方法，對分離得到的1株金黃色葡萄球菌進(jìn)行藥敏試驗，結(jié)果表明，頭孢噻呋MIC值為2 μg/mL，青霉素MIC值>2 μg/mL，氨芐西林MIC值>2 μg/mL，苯唑西林MIC值為1 μg/mL，四環(huán)素MIC值為1 μg/mL，復(fù)方新諾明MIC值≤0.5/9.5 μg/mL，環(huán)丙沙星MIC值為0.25 μg/mL，克林霉素MIC值>32 μg/mL，紅霉素MIC值為16 μg/mL，磺胺甲噁唑MIC值為128 μg/mL，替米考星MIC值>64 μg/mL，萬古霉素MIC值為1 μg/mL。

2.3.2 金黃色葡萄球菌耐藥性情況。CLSI M100S 26th Edtion標(biāo)準(zhǔn)中沒有頭孢噻呋（EFT），氨芐西林（AM）、替米考星等藥物對金黃色葡萄球菌的耐藥性判定標(biāo)準(zhǔn)無法對其結(jié)果做出有效的耐藥性分析。采用CLSI M100S 26th Edtion標(biāo)準(zhǔn)對此次藥物敏感性試驗結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)苯唑西林（OX）、四環(huán)素（TET）、復(fù)方新諾明（T/S）、環(huán)丙沙星（CFX）、萬古霉素等5種抗生素均可對金黃色葡萄球菌形成有效抑制。植株中檢出的金黃色葡萄球菌對青霉素、紅霉素、克林霉素及磺胺甲噁唑耐藥，為多重耐藥菌株。

3 結(jié)論與討論

此次風(fēng)險評估項目在生產(chǎn)過程中黃瓜、土壤、基肥、灌溉用水及植株中感染沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、單增李斯特氏菌的情況表明，黃瓜樣品、植株及土壤中各檢出一株大腸桿菌，植株中檢出一株金黃色葡萄球菌。因此沙門氏菌、單增李斯特氏菌可能不是影響其質(zhì)量安全的主要風(fēng)險因子，但在露天生產(chǎn)過程中金黃色葡萄球菌、大腸桿菌可能是影響其質(zhì)量安全的主要風(fēng)險因子。

土壤中大腸桿菌為敏感菌株且對13種抗生素均敏感，植株中大腸桿菌僅對氨曲南耐藥;黃瓜中大腸桿菌對氨芐西林、哌拉西林、氯霉素和四環(huán)素耐藥，為多重耐藥菌株。植株中金黃色葡萄球菌對青霉素、紅霉素、克林霉素及磺胺甲噁唑耐藥，為多重耐藥菌株。雖然土壤、植株及黃瓜中均檢出有大腸桿菌，但土壤、植株及黃瓜中的大腸桿菌耐藥情況卻有差異，因此有可能來源于不同種植環(huán)境中的致病微生物。

即食蔬菜是餐桌上最為常見的即食食品，尤其在夏季人均消費量很大，只經(jīng)過簡單的清洗即食用，因此發(fā)生交叉污染的可能性很大。此次調(diào)查監(jiān)測到的致病菌雖然檢出率不高，但仍需要引起相關(guān)部門的重視，希望有關(guān)部門加強(qiáng)對即食蔬菜的衛(wèi)生監(jiān)管，盡量減少食源性致病菌的交叉污染，減少由此可能引發(fā)的食源性疾病。

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