3種昆蟲黃酮提取物的大腸桿菌抑菌活性研究

孫宇辰 程吉云 張立愔 呂曉文 許龍

摘要 [目的]測定美洲大蠊、中華稻蝗、芫菁3種昆蟲體內(nèi)黃酮提取物的抑菌作用效果。 [方法]采用溶劑萃取法（SFE）提取3種昆蟲總黃酮，根據(jù)公式計算不同濃度的黃酮提取物對大腸桿菌的抑制率。[結(jié)果]其他條件相同時，美洲大蠊、中華稻蝗、芫菁3種昆蟲的黃酮濃度與抑制大腸桿菌繁殖的作用效果呈正相關(guān);濃度相同時，美洲大蠊黃酮體內(nèi)提取物抑菌效果最佳，中華稻蝗次之，芫菁的抑菌效果最弱。[結(jié)論]美洲大蠊、中華稻蝗、芫菁3種昆蟲黃酮提取物對大腸桿菌有一定的抑制作用。

關(guān)鍵詞 總黃酮;提取物;大腸桿菌;抑菌

中圖分類號 R282.74文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）14-0183-02

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.14.054

開放科學（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

Abstract [Objective]The research aimed to determine the antibacterial effect of total flavonoids in Periplaneta americana，Oxya chinensis and Mylabris phalerate.[Methods] Total flavonoids were extracted by solvent extraction （SFE）， and the inhibition rates of flavonoids extracts with different concentrations of three insects on Escherichia coli were calculated according to the formula.[Results] When other conditions were the same， the flavonoid concentrations of the three insects of Periplaneta americana，Oxya chinensis and Mylabris phalerate were positively correlated with the effect of inhibiting the reproduction of Escherichia coli.Under the same concentration， the flavonoids extracted from Periplaneta americana had the best bacteriostatic effect， followed by Oxya chinensis， and Mylabris phalerate had the weakest bacteriostatic effect.[Conclusion] Three insect flavonoid extracts of Periplaneta americana， Oxya chinensis and Mylabris phalerate have certain inhibitory effects on Escherichia coli.

Key words Total flavonoids;Extraction;Escherichia coli;Bacteriostatic

作者簡介 孫宇辰（1996—），女，黑龍江佳木斯人，碩士研究生，研究方向：資源昆蟲開發(fā)與應(yīng)用。*通信作者，教授，碩士生導(dǎo)師，從事昆蟲學研究。

收稿日期 2019-04-24;修回日期 2019-05-13

黃酮具有多方面醫(yī)療作用，能抗氧化、擴張血管、保持血管的彈性、抑制血小板活化因子、保護大腦等，可治療心腦血管、腎病綜合癥、糖尿病及血管型癡呆等疾病[1-2]。目前研究較多的是植物黃酮的提取，由于昆蟲黃酮的提取過程和成分都很復(fù)雜，所以昆蟲方面的研究相對很少[3-4]。該試驗用不同有機溶劑提取美洲大蠊、中華稻蝗、芫菁3種昆蟲的黃酮化合物，為今后昆蟲類總黃酮的提取提供參考;通過測定美洲大蠊、中華稻蝗、芫菁3種昆蟲體內(nèi)黃酮提取物對抑菌作用效果的研究，為今后昆蟲類黃酮提取物在抑菌抗菌方面奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 美洲大蠊（Periplaneta americana）、中華稻蝗（Oxya chinensis）、芫菁（Mylabris phalerata）均來自佳木斯大學生命科學學院動物學實驗室;菌種大腸桿菌（ Escherichia coli）來自于佳木斯大學生命科學學院微生物學實驗室。

1.2 方法

1.2.1 3種昆蟲總黃酮提取工藝。

1.2.1.1 溶劑種類的篩選。

將分揀好的美洲大蠊、中華稻蝗、芫菁烘干后粉碎，取2 g樣品用甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷5種有機溶劑萃取，在45 ℃的試驗環(huán)境下進行分離提純，其中，料液比為1∶8（g∶mL）。使用水浴法萃取8 h，共2次，將所得到的試驗溶液進行試驗結(jié)果測定，計算出黃酮的含量。

1.2.1.2 黃酮的提取。

取粉碎后樣品3.33 g，按1∶1（g∶mL）比例加入石油醚脫脂，室溫環(huán)境下使用100 mL濃度為50%的甲醇浸泡36 h，每3 h振蕩一次，繼續(xù)抽濾，用提取溶劑反復(fù)洗滌3次，待溶液中的甲醇揮發(fā)后定容至100 mL。

1.2.1.3 總黃酮含量的測定。繪制蘆丁標準曲線[5-6]，參考文獻[7]中的方法測定3種昆蟲總黃酮含量。

1.2.2 3種昆蟲黃酮提取物的大腸桿菌抑菌試驗。

1.2.2.1 菌種的活化及傳代培養(yǎng)。

配制 LB溶液200 mL，高溫殺菌。乙醇燈旁操作，選用K88和K99 2種菌種，同時放入5 mL的試管中，恒溫培養(yǎng)12 h，并設(shè)置對照試驗。循環(huán)操作，接種幾次大腸桿菌后，得到純度比較高的菌種，備用。

1.2.2.2 抑菌作用的定性判斷。將含有黃酮提取物和大腸桿菌的懸液用玻璃棒涂于培養(yǎng)皿上，在37 ℃下培養(yǎng)24 h，同時培養(yǎng)未添加黃酮提取物的對照組，觀察大腸桿菌的生長繁殖的數(shù)量和大小。

1.2.2.3 不同濃度黃酮提取物抑菌效果的測定。

將傳代大腸桿菌 K88和 K99均用0.9%氯化鈉溶液稀釋，將美洲大蠊、中華稻蝗、芫菁黃酮提取液配制成1 000.0、500.0、250.0、125.0、62.5 mg/mL 5種稀釋液，分別滴入不同的大腸桿菌培養(yǎng)基中，24 h后使用菌落計數(shù)器計算大腸桿菌的繁殖程度，多次試驗，計算均值。根據(jù)抑制率公式[8]計算不同濃度黃酮分離液的抗菌效果：抑制率=（CK菌落數(shù)-處理菌落數(shù)）/ CK菌落數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取劑的選擇

從表1可以看出，在相同條件下，甲醇最適合對美洲大蠊、中華稻蝗、芫菁黃酮進行提取，三氯甲烷最不適合對這3類黃酮化合物提取，說明不同的溶劑極性對美洲大蠊、中華稻蝗、芫菁黃酮的提取效果不同，溶劑的極性越大，提取效果就越好[9]。由于甲醇對人體有害，所以以下試驗均以乙醇為溶劑。

2.2 抑菌效果的定性判斷

大腸桿菌在含有黃酮化合物濃度較高的提取劑的培養(yǎng)基中，生長情況很不好，其繁殖數(shù)量遠小于對照組試驗，即黃酮提取劑很大程度上抑制了大腸桿菌的生長繁殖。

2.3 黃酮提取液濃度對抑菌效果的影響

從表2可以看出，對于美洲大蠊、中華稻蝗、芫菁3種昆蟲提取的黃酮類化合物而言，其濃度越高對大腸桿菌的抑制生長效果越強，即黃酮濃度對大腸桿菌抑菌效果成正比。濃度相同的情況下，美洲大蠊提取的黃酮類化合物抑菌效果最佳，中華稻蝗次之，芫菁的抑菌效果最弱。

2.4 黃酮提取物抑菌效果機理分析

從圖1可看出，添加適量的提取物后大腸桿菌數(shù)目降低，顯示在指數(shù)生長期內(nèi)菌的繁殖速度放緩，可能是菌在生長繁殖和代謝時受到了BLF的抑制。結(jié)合黃酮的結(jié)構(gòu)和以上結(jié)果推測黃酮提取物的抑制菌繁殖原理可能有2種：一是提取物中黃酮類物質(zhì)與細菌細胞壁中的糖類物質(zhì)結(jié)合，生成一種名為黃酮苷的物質(zhì)，它能夠破壞細胞壁中的糖苷鍵，使細菌細胞吸水漲破死亡;二是黃酮化合物中的黃酮分子含有親水性基團和疏水性基團，親水性基團和疏水性基團分別通過化學反應(yīng)和物理過程來破壞細菌細胞膜，使細菌失去膜的保護，從而細胞開始無止盡地吸水，最終結(jié)果就是細胞破裂死亡[10]。

3 結(jié)論

試驗結(jié)果表明，美洲大蠊、中華稻蝗、芫菁3種昆蟲的黃酮類物質(zhì)對大腸桿菌均有抑制作用。隨著黃酮類物質(zhì)濃度的增加，對大腸桿菌的抑制作用越顯著，即黃酮濃度與抑制大腸桿菌繁殖的作用呈正相關(guān);濃度相同的情況下，美洲大蠊提取的黃酮類化合物抑菌效果最佳，中華稻蝗次之，芫菁的抑菌效果最弱。該試驗對于昆蟲酮類化合物在抑菌抗菌研究方面具有積極意義。

參考文獻

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