高綠補(bǔ)血膠囊對(duì)大鼠血液指標(biāo)及骨髓細(xì)胞影響的研究

王紅明 俸一然 許東云

摘要：目的 觀察高綠補(bǔ)血膠囊對(duì)大鼠血常規(guī)、血生化、骨髓細(xì)胞的影響。方法 將Wistar大鼠隨機(jī)分為正常組、高綠補(bǔ)血膠囊初始、治療、負(fù)荷劑量組。觀察不同劑量高綠補(bǔ)血膠囊對(duì)大鼠血液指標(biāo)及骨髓細(xì)胞的影響。結(jié)果 高綠補(bǔ)血膠囊治療劑量組AST/ALT下降（P<0.05），高綠補(bǔ)血膠囊治療劑量及負(fù)荷劑量均能夠上調(diào)大鼠白細(xì)胞水平（P<0.05）。高綠補(bǔ)血膠囊能促進(jìn)骨髓細(xì)胞的增殖及鐵元素的吸收。結(jié)論 高綠補(bǔ)血膠囊能一定程度提高大鼠的造血功能及免疫力，且不對(duì)大鼠肝腎功能產(chǎn)生損傷。

關(guān)鍵詞：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎合并貧血;高綠補(bǔ)血膠囊

中圖分類號(hào)：R285 ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ? 文章編號(hào)：1007-2349（2019）07-0059-04

【Abstract】Objective： To observe the effect of Gaolu Buxue Capsule on blood routine， blood biochemistry and bone marrow cells in rats. Methods： Wistar rats were randomly divided into a normal group， Gaolu Buxue capsule groups with initial， treatment and loading-dose to observe the effects of different doses of Gaolu Buxue Capsule on blood parameters and bone marrow cells in rats. Results： The AST/ALT in the treatment group of Gaolu Buxue Capsule decreased （P<0.05）. The treatment dose and loading dose of Gaolu Buxue Capsule could up-regulate the white blood cell level of rats （P<0.05）. Gaolu Buxue Capsule could promote the proliferation of bone marrow cells and the absorption of iron element. Conclusion： Gaolu Buxue Capsule can improve the hematopoietic function and immunity of rats to a certain extent， and does not damage the liver and kidney function of rats.

【Key words】rheumatoid arthritis combined with anemia， Gaolu Buxue Capsule

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種主要累及關(guān)節(jié)的自身免疫性疾病，常有其他系統(tǒng)和重要臟器受累，貧血（Anemia）是RA最常見的關(guān)節(jié)外表現(xiàn)之一[1]，其發(fā)病機(jī)制中鐵代謝紊亂[2-3]和相關(guān)細(xì)胞因子[4-5]占了關(guān)鍵的因素。現(xiàn)研究高綠補(bǔ)血膠囊對(duì)血常規(guī)、血生化、骨髓細(xì)胞的影響，以大鼠為動(dòng)物模型，檢測(cè)血常規(guī)及血生化的表達(dá)并觀測(cè)骨髓細(xì)胞形態(tài)及骨髓內(nèi)外鐵等實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，探討高綠補(bǔ)血膠囊的藥理特性，明確其治療的作用靶點(diǎn)及方向，為中醫(yī)藥防治RA合并貧血[6-7]的安全合理用藥提供可靠的理論和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和藥品 選取SPF級(jí)Wistar雌性大鼠48只，8周齡，體重（200±20）g，健康，由昆明楚商科技有限公司提供。

高綠補(bǔ)血膠囊，300 mg/粒，由專利負(fù)責(zé)人許東云提供配方，昆明市醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所濃縮制備為高綠補(bǔ)血膠囊湯劑。

1.2 藥物劑量的確立 高綠補(bǔ)血膠囊規(guī)格為300 mg/粒，成人服用劑量為2 粒/次，日2 次，共1200 mg·d-1 。按照人與動(dòng)物藥物劑量的換算方法，采取體表面積折算方法計(jì)算，換算劑量為24 mg·d-1，按大鼠體重200 g/只計(jì)算，則治療劑量組為120 mg·kg-1·d-1，按照藥理研究要求，取1/3 治療劑量為初始劑量，即40 mg·kg-1·d-1，取3倍治療劑量為負(fù)荷劑量，即480 mg·kg-1·d-1。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 藥物干預(yù)及取材 48只大鼠隨機(jī)分成4組，A組：正常對(duì)照組;B組：高級(jí)補(bǔ)血膠囊初始劑量組;C組：高級(jí)補(bǔ)血膠囊治療劑量組;D組：高級(jí)補(bǔ)血膠囊負(fù)荷劑量組。除正常對(duì)照組外分別每天等體積不同濃度梯度高綠補(bǔ)血膠囊溶液灌胃。給藥療程：參照藥理研究要求，實(shí)驗(yàn)的總給藥時(shí)間定為21 d，大鼠灌胃容量定為1.0 mL/只。連續(xù)21 d灌胃結(jié)束后24h內(nèi)心臟取抗凝血標(biāo)本約2 mL送檢，頸椎脫臼處死，分離出股骨骨髓行普魯士染色、瑞氏染色后顯微鏡下拍照。

1.3.2 大鼠血常規(guī)、血生化的測(cè)量 心臟取抗凝血標(biāo)本約2 mL，應(yīng)用血常規(guī)分析儀和血生化分析儀進(jìn)行大鼠血常規(guī)、肝腎功測(cè)定。

1.3.3 骨髓細(xì)胞內(nèi)、外鐵染色觀察 剪斷股骨兩端，用空注射器（抽取一定量的空氣）打出骨髓液，迅速推片，晾干。骨髓普魯士染色采用索萊寶 G1422普魯士藍(lán)染色試劑盒（核固紅法）進(jìn)行。 固定、染色、脫水透明、中性樹膠封片后顯微鏡下觀察拍照。

結(jié)果判定：含鐵血黃素或三價(jià)鐵被染成藍(lán)色;細(xì)胞核、其他組織被染成紅色。

1.3.4 骨髓細(xì)胞形態(tài)觀察 剪斷股骨兩端，用空注射器（抽取一定量的空氣）打出骨髓液，迅速推片，晾干。骨髓瑞氏染色采用索萊寶 G1040瑞氏染液進(jìn)行。固定、染色、脫水透明、中性樹膠封片后顯微鏡下觀察拍照。

結(jié)果判定：細(xì)胞被染成藍(lán)色;胞漿被染成紅色;細(xì)胞核被染成紫紅色。

2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析，各組間計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組內(nèi)比較用方差齊性檢驗(yàn)，多組間兩兩比較用t 驗(yàn)驗(yàn);所有單向等級(jí)資料的比較用秩和檢驗(yàn)和Ridit檢驗(yàn);統(tǒng)計(jì)學(xué)差異標(biāo)準(zhǔn)設(shè)為P<0.05。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 大鼠一般狀況的改變 服用高綠補(bǔ)血膠囊后大鼠體力、精神及活動(dòng)度較正常組明顯上升，但各藥物組間大鼠體力、精神及活動(dòng)度改善未見明顯差異。

3.2 各組藥物對(duì)大鼠血常規(guī)及血生化指標(biāo)的影響 見表1及表2。

血常規(guī)及血生化的比較結(jié)果：1.與其它各組相比較高綠補(bǔ)血膠囊治療劑量組對(duì)大鼠AST/ALT比值存在下調(diào)作用（P<0.05），但其對(duì)ALT和AST無相應(yīng)的影響（P>0.05）;2.與正常組、高綠補(bǔ)血膠囊初始劑量組相比，高綠補(bǔ)血膠囊治療劑量及負(fù)荷劑量均能夠上調(diào)大鼠白細(xì)胞水平（P<0.05），但高綠補(bǔ)血膠囊治療劑量及負(fù)荷劑量之間上調(diào)水平無明顯差別（P>0.05）。

結(jié)果表明：高綠補(bǔ)血膠囊能一定程度提高大鼠免疫力，且不對(duì)大鼠肝腎功能產(chǎn)生損傷。

3.3 各組藥物對(duì)大鼠骨髓細(xì)胞內(nèi)外鐵及骨髓細(xì)胞增殖的影響

3.3.1 對(duì)骨髓細(xì)胞內(nèi)外鐵的影響 鏡下觀察各組大鼠骨髓細(xì)胞內(nèi)外鐵的含量（圖1），根據(jù)細(xì)胞外鐵顆粒、鐵小珠和鐵小塊的多少和細(xì)胞內(nèi)鐵顆粒數(shù)目、大小、染色深淺，將細(xì)胞外鐵含量分為五級(jí)[8]（表3）。

對(duì)骨髓細(xì)胞內(nèi)外鐵的影響：與正常組相比，高綠補(bǔ)血膠囊各個(gè)劑量組均能夠促進(jìn)骨髓細(xì)胞攝取鐵（P<0.05），其促進(jìn)能力隨劑量的提升而提升。

結(jié)果表明：高綠補(bǔ)血膠囊能促進(jìn)骨髓細(xì)胞吸收鐵元素。

3.3.2 對(duì)骨髓細(xì)胞增殖的影響 鏡下觀察各組大鼠骨髓細(xì)胞的增殖情況（圖2），根據(jù)細(xì)胞數(shù)目、大小、染色深淺，將骨髓細(xì)胞增殖情況分為五級(jí)（表4）。

對(duì)骨髓細(xì)胞增殖的影響：與正常組相比，高綠補(bǔ)血膠囊各個(gè)劑量組均能夠促進(jìn)骨髓細(xì)胞的增殖（P<0.05），其促進(jìn)能力治療劑量組最強(qiáng)。

結(jié)果表明：高綠補(bǔ)血膠囊能促進(jìn)骨髓細(xì)胞的增殖。

4 討論

目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為RA 合并貧血的發(fā)病機(jī)制中鐵代謝紊亂和相關(guān)細(xì)胞因子占了重要的因素，主要體現(xiàn)在三個(gè)病理生理方面：1、鐵代謝紊亂[9]; 2、紅細(xì)胞壽命縮短：RA 患者細(xì)胞因子激活[4];3、骨髓代償不足[10]。

中醫(yī)認(rèn)為RA合并貧血屬于“尪痹病”的氣血虛弱證型，其病因以氣血虧虛為要，《景岳全書·風(fēng)痹》[11]曰：“痹者，閉也。以氣血為邪所閉，不得通行為病也。”該疾病的治療以補(bǔ)益氣血為要[12]，方能達(dá)到治療效果，正如《醫(yī)宗必讀卷十·痹》[13]中所言：“治行痹者，散風(fēng)為主，御寒利濕仍不可廢，大抵參以補(bǔ)血之劑，蓋治風(fēng)先治血，血行風(fēng)自滅也?！?/p>

本次研究旨在探索高綠補(bǔ)血膠囊對(duì)正常大鼠的各項(xiàng)血液指標(biāo)及骨髓細(xì)胞的影響，并以此研究與貧血模型大鼠的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行對(duì)照，以便于進(jìn)一步的摸索高綠補(bǔ)血膠囊對(duì)貧血模型大鼠的影響因素。此次研究結(jié)果表明：①高綠補(bǔ)血膠囊對(duì)正常大鼠體力、睡眠、精神及活動(dòng)度均有一定程度的改善作用。②高綠補(bǔ)血膠囊不對(duì)正常大鼠肝腎功能產(chǎn)生損傷。③高綠補(bǔ)血膠囊各劑量均能夠繼續(xù)上調(diào)正常大鼠白細(xì)胞水平，提示其能一定程度提高正常大鼠免疫力。④高綠補(bǔ)血膠囊各劑量均增加正常大鼠骨髓細(xì)胞內(nèi)外鐵的含量、促進(jìn)骨髓細(xì)胞的增殖，提示其促進(jìn)正常大鼠骨髓細(xì)胞的增殖及鐵元素的吸收。

高綠補(bǔ)血膠囊[14]系專利發(fā)明人許東云經(jīng)過十多年的醫(yī)學(xué)生物研究和臨床實(shí)踐研究總結(jié)，根據(jù)中醫(yī)對(duì)RA 合并貧血的發(fā)生機(jī)理和治療原則[15-16]，以結(jié)合中醫(yī)整體調(diào)節(jié)觀組方，利用我省特有的綠色生物資源螺旋藻[17-18]，形成能全面調(diào)理人體造血機(jī)能，補(bǔ)充造血營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)貧血改善效果快[19]，且效果容易驗(yàn)證和觀察的產(chǎn)品。該配方以螺旋藻及動(dòng)物鐵為君藥以補(bǔ)益氣血及調(diào)節(jié)鐵代謝，佐以茯苓及山藥以健脾益氣生血，全方共奏健脾益氣生血之效。且使用云南高原特色的食用生物原料及中藥，利用現(xiàn)代生物技術(shù)制備生產(chǎn)，2001 年經(jīng)過小量制備試用觀察研究證明：其有效性高、安全性好。

因此，通過檢測(cè)血常規(guī)及血生化的表達(dá)并觀測(cè)骨髓形態(tài)及骨髓內(nèi)外鐵等實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，能為進(jìn)一步的探索中藥制劑對(duì)RA并貧血模型的研究提供一定的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

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