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    高效液相色譜法測定復(fù)方氨基酸(15)腹膜透析液中色氨酸降解產(chǎn)物

    2019-08-27 08:11:16謝紀(jì)珍崔師睿尹寧寧姜曉飛
    食品與藥品 2019年4期

    謝紀(jì)珍,崔師睿,周 沖*,尹寧寧,姜曉飛

    (1.山東省食品藥品審評認(rèn)證中心,山東 濟(jì)南 250014;2.山東農(nóng)業(yè)工程學(xué)院,山東 濟(jì)南 250100)

    復(fù)方氨基酸(15)腹膜透析液是一種用氨基酸替代葡萄糖作為滲透劑,用于營養(yǎng)不良的腹膜透析患者的新型透析治療產(chǎn)品。其處方組成復(fù)雜,含有包括色氨酸在內(nèi)的15種氨基酸等,目前測定氨基酸含量的方法很多,包括高效液相色譜法(HPLC)、氨基酸分析儀、衍生化法等[1-2],但測定各種氨基酸降解產(chǎn)物的方法較少,本文選擇穩(wěn)定性較差的色氨酸為例[3],對其檢測方法進(jìn)行研究。在日常審評過程中發(fā)現(xiàn),不同檢測方法檢出的色氨酸中降解產(chǎn)物和雜質(zhì)個(gè)數(shù)均不同,通過對比美國藥典、歐洲藥典、英國藥典等收載的各種氨基酸原料的檢測方法,色氨酸是唯一一個(gè)采用HPLC測定降解雜質(zhì)的氨基酸,其中歐洲藥典對色氨酸雜質(zhì)的檢測相對完整,其收錄的色氨酸原料的雜質(zhì)從合成過程中引入的雜質(zhì)和降解雜質(zhì)共有12個(gè),并對其中的雜質(zhì)A采用HPLC法檢測[5-8]。通過研究發(fā)現(xiàn),該方法在評價(jià)色氨酸原料的穩(wěn)定性方面基本可行,但復(fù)方氨基酸(15)腹膜透析液含有十幾種氨基酸組分,這些組分會干擾色氨酸雜質(zhì)的測定,上述藥典中的檢測方法專屬性較差,不能有效地評價(jià)色氨酸的穩(wěn)定性,為此本研究對檢測方法進(jìn)行了優(yōu)化和驗(yàn)證。

    在參考文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上[4,9-10],本研究進(jìn)一步優(yōu)化色譜條件,建立了一種專屬性更強(qiáng)的方法檢測制劑中色氨酸的降解雜質(zhì),測定并比較了自制復(fù)方氨基酸(15)腹膜透析液與上市品中的色氨酸降解雜質(zhì),為與本品類似的制劑產(chǎn)品開發(fā)提供了一種有效的質(zhì)量控制和評價(jià)手段。

    1 材料與試藥

    Agilent1100型高效液相色譜儀,DAD檢測器,自動進(jìn)樣器,Aglient Chemstation色譜工作站;XS205型電子天平(梅特勒-托利多);PHS-3C型pH計(jì)(上海雷磁儀器廠)。色氨酸(中國食品藥品檢定研究院,批號140624-201506);色氨酸雜質(zhì)B(加拿大TLC Pharmaceutical Standards公司,批號1385-088A2);色氨酸雜質(zhì)C(犬尿氨酸,美國Sigma-Aldrich公司,批號BCBN9808V);色氨酸雜質(zhì)E(N-甲酰犬尿氨酸,雜質(zhì)批號1406-083A3),色氨酸雜質(zhì)G(2-羥基色氨酸,批號1406-094A3,加拿大TLC Pharmaceutical Standards公司)。復(fù)方氨基酸(15)腹膜透析液(青島力騰化工醫(yī)藥研究有限公司,批號C17031701,C17031702,C17031703);另選某公司已上市復(fù)方氨基酸(15)腹膜透析液做對比研究,批號:S15G03096。

    2 方法

    2.1 雜質(zhì)對照溶液配制

    精密稱取雜質(zhì)B、犬尿氨酸、N-甲酰犬尿氨酸、2-羥基色氨酸適量,加水制成濃度分別為99.6,107.8,119.2,97.2 μg/ml的對照溶液。2~8 ℃密封保存?zhèn)溆谩?/p>

    2.2 空白對照溶液配制

    按照復(fù)方氨基酸(15)腹膜透析液處方,稱取除色氨酸以外的其他組分,加水,制成空白對照溶液。

    2.3 對照混合溶液配制

    精密稱取雜質(zhì)B、犬尿氨酸、N-甲酰犬尿氨酸、2-羥色氨酸適量,用純化水溶解,制成各組分濃度約為0.50 μg/ml對照溶液,量取1 ml,加入100 ml復(fù)方氨基酸(15)腹膜透析液樣品中。

    2.4 色譜條件

    以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以純水為流動相A,以0.02 mol/L磷酸二氫鉀(磷酸調(diào)pH 2.7)-乙腈-異丙醇(650:175:175)為流動相B,柱溫50 ℃,按表1進(jìn)行梯度洗脫;檢測波長為250 nm。

    表1 流動相洗脫梯度

    2.5 測定法

    取上述雜質(zhì)對照溶液、空白對照溶液、對照混合溶液以及自制和上市的復(fù)方氨基酸(15)腹膜透析液各50 μl,注入色譜儀,記錄色譜圖至保留時(shí)間70 min。各雜質(zhì)按外標(biāo)法計(jì)算不得大于0.2 %,最大其他雜質(zhì)不得大于0.2 %,總雜質(zhì)不得過1.0 %。

    3 方法對比與方法學(xué)驗(yàn)證

    3.1 色譜條件比較

    氧化破壞樣品制備 稱取色氨酸對照品適量,加純化水溶解,取5 ml加30 %雙氧水5 ml,置入10 ml量瓶,于60 ℃下放置5 h,取出待用。取氧化破壞樣品溶液,分別用歐洲藥典8.0[2]中收載的色譜條件與上述優(yōu)化后色譜條件分析測定。

    結(jié)果:由圖1、圖2比較可見,氧化破壞后的樣品采用自研的方法檢測可將4個(gè)雜質(zhì)全部檢出,而采用歐洲藥典方法檢出的雜質(zhì)個(gè)數(shù)和分離度均較差(本文各圖中標(biāo)號代表:1:雜質(zhì)B,2:犬尿氨酸,3:N-甲酰犬尿氨酸,4:2-羥基色氨酸,5:色氨酸,6:苯丙氨酸,7:酪氨酸,8:雙氧水)。

    圖1 歐洲藥典方法測定氧化后色氨酸溶液色譜圖

    3.2 專屬性

    3.2.1 原輔料空白試驗(yàn) 按處方配制除色氨酸以外的各原輔料空白溶液、各雜質(zhì)混合對照溶液、以及加各雜質(zhì)對照的混合樣品溶液,照2.4和2.5項(xiàng)下色譜條件與測定法測定。

    結(jié)果:由圖3~圖5可見,色氨酸的4個(gè)雜質(zhì)在復(fù)方氨基酸(15)腹膜透析液的樣品中可有效分離,樣品中的色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸均不影響4個(gè)雜質(zhì)的測定。

    圖3 雜質(zhì)對照溶液色譜圖

    圖4 空白溶液色譜圖

    圖5 加雜質(zhì)對照的混合樣品溶液色譜圖

    3.2.2 破壞性試驗(yàn) 將氨基酸(15)腹膜透析液分別于高溫、光照、氧化條件下破壞。

    圖6 注射液光照破壞色譜圖

    圖7 注射液氧化破壞色譜圖

    圖8 注射液高溫破壞色譜圖

    結(jié)果:本方法能良好的分離注射液在光照、高溫、氧化條件下降解各雜質(zhì),且主峰純度符合要求。

    3.3 復(fù)方氨基酸(15)腹膜透析液樣品中雜質(zhì)檢測

    由圖9、圖10可見,自制的復(fù)方氨基酸(15)腹膜透析液中色氨酸的雜質(zhì)要低于上市品(已上市12個(gè)月)中的雜質(zhì)水平。

    圖9 氨基酸(15)腹膜透析液上市樣品色譜圖

    圖10 氨基酸(15)腹膜透析液自制樣品色譜圖

    3.4 線性范圍

    分別取2.1項(xiàng)下各對照溶液適量,加水稀釋成系列濃度后照2.4和2.5項(xiàng)下色譜條件與測定法進(jìn)行測定。以峰面積對濃度作回歸方程,結(jié)果見表2,表明各雜質(zhì)濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系,符合要求。

    表2 雜質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)線性曲線

    3.5 檢測限、定量限

    分別取2.1項(xiàng)下各對照溶液適量,加水連續(xù)稀釋后照2.4和2.5項(xiàng)下色譜條件與測定法測定,直至信噪比為10:1時(shí),該濃度為定量限濃度;當(dāng)信噪比為3:1時(shí),該濃度為檢出限濃度;配制6份定量限濃度對照混合溶液,連續(xù)進(jìn)樣,計(jì)算其RSD,應(yīng)符合要求。6份定量限樣品峰面積RSD值小于5 %,保留時(shí)間RSD小于2 %。結(jié)果見表3。

    表3 雜質(zhì)的檢測限和定量限

    3.6 精密度

    重復(fù)性試驗(yàn):取2.2項(xiàng)下混合樣溶液,照2.4和2.5項(xiàng)下色譜條件與測定法,測定6份樣品中雜質(zhì)B、犬尿氨酸、N-甲酰犬尿氨酸、2-羥基色氨酸的含量。結(jié)果表明,6份樣品中雜質(zhì)B平均含量為0.5362 μg/ml,RSD為4.6 %,犬尿氨酸平均含量為0.5399 μg/ml,RSD為0.8 %,N-甲酰犬尿氨酸平均含量為0.5216 μg/ml,RSD為2.6 %,2-羥基色氨酸平均含量為0.5488 μg/ml,RSD為2.2 %。

    表4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

    中間精密度試驗(yàn):取2.2項(xiàng)下混合樣溶液,照2.4和2.5項(xiàng)下色譜條件與測定法,由不同的儀器、試驗(yàn)人員測定相同的6份樣品雜質(zhì)含量,計(jì)算12份樣品的RSD值。結(jié)果表明,12份樣品中雜質(zhì)B平均含量為0.5154 μg/ml,RSD為6.6 %,犬尿氨酸平均含量為0.5197 μg/ml,RSD為4.2 %,N-甲酰犬尿氨酸平均含量為0.5248 μg/ml,RSD為3.0 %,2-羥基色氨酸平均含量為0.5406 μg/ml,RSD為4.1 %。

    結(jié)論:由上述重復(fù)性試驗(yàn)與中間精密度試驗(yàn)結(jié)果可知,該方法精密度良好。

    3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

    取2.1項(xiàng)下各對照溶液,照2.4和2.5項(xiàng)下色譜條件與測定法,分別于0,4,8,12,24 h取樣測定其穩(wěn)定性。結(jié)果雜質(zhì)B、犬尿氨酸、N-甲酰犬尿氨酸和2-羥基色氨酸的樣品峰面積RSD分別為1.9 %,0.9 %,1.1 %和0.7 %。

    3.8 回收率

    精密量取2.1項(xiàng)下各對照溶液適量,按照低、中、高3個(gè)濃度稀釋配制含有4種雜質(zhì)的溶液,每個(gè)濃度配制3份,共配制9份樣品溶液,其中低濃度為定量限濃度。照2.4和2.5項(xiàng)下色譜條件與測定法。結(jié)果雜質(zhì)B、犬尿氨酸、N-甲酰犬尿氨酸和2-羥基色氨酸的平均回收率分別為101.78 %,106.31 %,104.86 %和100.71 %。詳見表5~8。

    表5 雜質(zhì)B回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

    表6 犬尿氨酸回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

    表7 N-甲酰犬尿氨酸回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

    表8 2-羥基色氨酸回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

    3.9 耐用性

    分別考察流動相比例、流動相pH值、柱溫、檢測波長、流速不同色譜柱等方法因素發(fā)生變化時(shí),該方法的耐受程度。每個(gè)條件下各測試2次??山邮艿臉?biāo)準(zhǔn)為:各雜質(zhì)峰的拖尾因子不得大于2.0,雜質(zhì)峰與其他成分峰必須達(dá)到基線分離;各條件下的雜質(zhì)含量數(shù)據(jù)(n=6)的相對標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)不大于2.0 %,雜質(zhì)含量的絕對值在±0.1 %以內(nèi)。

    結(jié)果表明,上述各影響因素變化條件下,除流速為0.6 ml/min時(shí)分離度最小為1.43,其余各條件理論塔板數(shù)均大于10 000,分離度均大于1.5。犬尿氨酸、N-甲酰犬尿氨酸各影響因素條件下6份含量數(shù)據(jù)RSD值小于2.0 %,雜質(zhì)B略過,最高RSD值為7.1 %,但對有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果無明顯影響。

    綜合上述,該方法空白原輔料無干擾,有關(guān)物質(zhì)能夠?qū)崿F(xiàn)良好的分離,專屬性強(qiáng);定量限濃度均低于0.05 %,該方法靈敏度高;準(zhǔn)確度、精密度良好,各雜質(zhì)自定量限濃度至0.5 %范圍內(nèi)濃度與峰面積成良好的線性關(guān)系;溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定,能夠滿足測定需求,系統(tǒng)適用性與耐用性良好。該方法能夠滿足本品中色氨酸有關(guān)物質(zhì)檢測要求。

    3.10 樣品測定

    取自制復(fù)方氨基酸(15)腹膜透析液3批及市售產(chǎn)品,照2.4和2.5項(xiàng)下色譜條件與測定法測定。結(jié)果見表9。

    表9 復(fù)方氨基酸(15)腹膜透析液中色氨酸降解產(chǎn)物測定結(jié)果

    4 討論

    歐洲藥典收錄的檢測方法在評價(jià)復(fù)方氨基酸制劑中色氨酸雜質(zhì)時(shí),受其他氨基酸組分影響,其專屬性差,不能有效檢測色氨酸的降解雜質(zhì)。我們在其方法基礎(chǔ)上改進(jìn)優(yōu)化了HPLC色譜條件,可對其主要的降解產(chǎn)物進(jìn)行分離檢測,經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證,可用于多種含色氨酸的復(fù)方氨基酸制劑工藝和質(zhì)量評價(jià),希望給研究者提供參考。

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