小兒牛黃清心散遺傳毒性研究

曲見松，祝清芬，趙 巖，孫昌華，趙艷霞，杜新磊，高 峰，張國印

（1.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 濟(jì)南 250101；2.山東廣育堂國藥有限公司，山東 濟(jì)寧 272000）

小兒牛黃清心散主要由天麻、膽南星、黃連等十四味中藥配伍而成，收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第2冊，為臨床較為常用的藥物，具有清熱化痰、鎮(zhèn)靜止痙的功效，對小兒支氣管肺炎、上呼吸道感染、熱性驚厥、小兒季節(jié)性流感和皰疹性咽峽炎等疾病具有較好的療效[1-5]。目前國內(nèi)外對中藥安全性的評價(jià)研究日益引起關(guān)注，對于常用的組方藥物的功效也逐步使用試驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行深入研究[6-10]。經(jīng)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，目前國內(nèi)外對小兒牛黃清心散是否具有遺傳毒性的研究尚未見報(bào)道?？紤]到小兒牛黃清心散使用對象的特殊性，有必要對其遺傳毒性進(jìn)行評價(jià)。本文采用遺傳毒性標(biāo)準(zhǔn)組合試驗(yàn)對小兒牛黃清心散的遺傳毒性進(jìn)行了研究[11-12]。

1 儀器與材料

1.1 儀器

BP 211D電子天平（德國Sartorius公司）；高壓蒸汽滅菌器（日本SANYO公司）；隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒）；Stuart溫控?fù)u床培養(yǎng)箱（英國Stuart公司）；BSC-1100A2生物安全柜（北京中聯(lián)哈爾儀器公司）；INC153二氧化碳培養(yǎng)箱（德國Memmert公司）；LEICA DMIL倒置顯微鏡（德國徠卡公司）。

1.2 試劑

小兒牛黃清心散（山東方健制藥）；肝微粒體酶S9（上海寶錄）；敵克松（Chem Service公司）；注射用絲裂霉素（浙江海正藥業(yè)）；2-氨基芴（上海晶純試劑公司）；1, 8-二羥基蒽醌（Sigma-Aldrich公司）；環(huán)磷酰胺（Sigma-Aldrich公司）；DMEM培養(yǎng)液（Hyclone公司）；胎牛血清（浙江天杭）；胰蛋白酶（賽默飛世爾）；Giemsa染料（Salarbio公司）；甲醇（天津康科德）；滅菌注射用水（華仁藥業(yè)）。

1.3 試驗(yàn)系統(tǒng)

1.3.1 菌株 鼠傷寒沙門氏菌株TA97a，TA98，TA100，TA102，TA1535（上海寶錄）。

1.3.2 細(xì)胞株 中國倉鼠肺成纖維細(xì)胞（CHL，中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會昆明細(xì)胞庫）。

1.3.3 動(dòng)物 ICR小鼠，SPF級，購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（魯）20140007。實(shí)驗(yàn)在山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院屏障環(huán)境內(nèi)進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號：SYXK（魯）20130012。

2 方法

2.1 Ames試驗(yàn)

TA97a，TA98，TA100，TA102，TA1535 5種菌株經(jīng)鑒定符合鼠傷寒沙門菌組氨酸缺陷型的各項(xiàng)特性，體外活化系統(tǒng)S9為Aroclor1254誘導(dǎo)雄性SD大鼠肝勻漿。試驗(yàn)設(shè)8，40，200，1000，5000 μg/皿5個(gè)劑量。將受試藥物配制成0.08，0.4，2，10，50 mg/ml 5個(gè)濃度，0.055 MPa滅菌20 min，試驗(yàn)時(shí)，每皿加入各個(gè)劑量組受試物0.1 ml。同時(shí)設(shè)立自發(fā)回變組、溶媒對照組和陽性對照組。每組設(shè)3個(gè)平皿。在加 S9與不加 S9混合液的條件下以平板摻入法進(jìn)行試驗(yàn)，陽性對照組所用陽性物為敵克松、2-氨基芴、絲裂霉素C和1, 8-二羥基蒽醌。若受試物的回變菌落數(shù)為自發(fā)回變菌落數(shù)的2倍以上，并具有劑量-反應(yīng)關(guān)系則判定為陽性。試驗(yàn)在相同條件下進(jìn)行2次以確保結(jié)果的可重復(fù)性。

2.2 CHL細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)

采用生長狀態(tài)良好的CHL細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。用0.25 %的胰酶將細(xì)胞消化，吹打均勻后重新分瓶培養(yǎng)，接種的細(xì)胞密度為1×105個(gè)/ml。試驗(yàn)在代謝活化（加S9）和非代謝活化（不加S9）條件下進(jìn)行。非代謝活化條件下，受試藥品與細(xì)胞分別接觸4，24 h，代謝活化條件下，受試樣品與細(xì)胞接觸4 h。低、中、高劑量組藥物終濃度均分別為250，500，1000 μg/ml。試驗(yàn)同時(shí)設(shè)陰性對照組和陽性對照組。各組收獲細(xì)胞前4 h加入終濃度為0.8 μg/ml的秋水仙堿，胰酶消化，離心收集細(xì)胞，用0.075 mol/L氯化鉀溶液將細(xì)胞進(jìn)行低滲處理，甲醇-冰醋酸液固定，離心，取混勻沉淀物常規(guī)制片，姬姆薩染色。油鏡下觀察染色體結(jié)構(gòu)畸變種類、頻率，每例樣本鏡檢200個(gè)中期相細(xì)胞，記錄染色體數(shù)目及形態(tài)的變化。

2.3 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)

取健康ICR小鼠50只，按體重隨機(jī)分為供試品500，1000，2000 mg/kg 3個(gè)劑量組、陰性對照組和環(huán)磷酰胺50 mg/kg陽性對照組，每組10只，雌雄各半。各組小鼠分別灌胃給予相應(yīng)的藥物溶液20 ml/kg，陰性對照組經(jīng)口灌胃給予等容積的滅菌注射用水。采用30 h兩次給藥法，即兩次給藥間隔24 h，于第二次給予受試物后6 h將動(dòng)物頸椎脫臼處死，取胸骨骨髓常規(guī)制片、姬姆薩染色。顯微鏡閱片，每只小鼠骨髓涂片觀察2000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞（PCE），計(jì)數(shù)出現(xiàn)微核的PCE，計(jì)算微核率，微核率以千分率表示。每只小鼠骨髓涂片至少觀察200個(gè)PCE細(xì)胞，并計(jì)算嗜多染紅細(xì)胞與總紅細(xì)胞[正染紅細(xì)胞（NCE）+PCE]的比例。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 Ames試驗(yàn)結(jié)果

受試物各劑量組在加/不加S9（+/-S9）條件下各菌株回變菌落數(shù)均未超過自發(fā)回變菌落數(shù)的2倍，各劑量組間亦無劑量反應(yīng)關(guān)系。兩次試驗(yàn)結(jié)果表明，在本試驗(yàn)條件下，在加與不加代謝活化系統(tǒng)的情況下，受試物為致突變陰性，結(jié)果見表1、表2。

表1 小兒牛黃清心散Ames試驗(yàn)結(jié)果（，第1次試驗(yàn)）

表1 小兒牛黃清心散Ames試驗(yàn)結(jié)果（，第1次試驗(yàn)）

注：**P＜0.01 vs 陰性對照組；1) 敵克松50 μg/皿；2) 2-氨基芴10 μg/皿；3) 絲裂霉素C 0.5 μg/皿；4) 1,8二羥基蒽醌50 μg/皿

組別 活化系統(tǒng)TA97a回變菌落數(shù)（n=3)TA98 TA100 TA102 TA1535陰性對照組 -S9 126±8 34±5 137±8 259±12 33±3 132±11 38±3 147±10 253±11 36±3陽性對照組 -S9 2147±9911)** 1965±1111)** 993±721)** 873±783)** 429±611)**2261±1202)** 2147±1052)** 1149±742)** 980±1114)** 309±242)**自發(fā)回變組 -S9 125±9 31±6 139±8 263±11 38±6 135±7 35±3 148±9 259±12 38±6 5000 μg/皿 -S9 107±13 29±5 134±11 241±7 32±3+S9 115±6 34±3 133±7 251±12 33±4 1000 μg/皿 -S9 117±14 32±6 136±13 265±8 35±6+S9 125±8 37±4 145±12 257±13 40±5 200 μg/皿 -S9 123±8 32±3 142±9 263±11 38±3+S9 127±11 38±3 153±8 265±14 34±2 40 μg/皿 -S9 129±12 35±4 136±12 259±10 34±4+S9 134±13 39±5 143±14 254±7 37±5 8 μg/皿 -S9 127±6 32±5 139±8 258±9 34±5+S9 131±5 40±4 140±12 264±11 35±4給藥組

表2 小兒牛黃清心散Ames試驗(yàn)結(jié)果（，第2次試驗(yàn)）

表2 小兒牛黃清心散Ames試驗(yàn)結(jié)果（，第2次試驗(yàn)）

注：**P＜0.01 vs 陰性對照組；1) 敵克松50 μg/皿；2) 2-氨基芴10 μg/皿；3) 絲裂霉素C 0.5 μg/皿；4) 1,8二羥基蒽醌50 μg/皿

組別 活化系統(tǒng)TA97a回變菌落數(shù)（n=3）TA98 TA100 TA102 TA1535陰性對照組 -S9 120±11 32±4 145±10 260±8 36±4 135±7 36±3 143±10 265±9 38±2陽性對照組 -S9 2148±1191)** 2035±811)** 1061±911)** 869±343)** 423±371)**2125±1122)** 2412±2332)** 1099±602)** 855±814)** 297±502)**自發(fā)回變組 -S9 125±10 34±5 149±9 259±10 36±6 137±5 37±4 144±8 263±14 37±4 5000 μg/皿 -S9 112±11 32±3 126±9 256±10 30±3+S9 124±9 34±4 137±10 252±11 31±3 1000 μg/皿 -S9 122±7 33±3 134±5 261±8 40±5+S9 136±9 38±5 141±13 257±12 34±4 200 μg/皿 -S9 121±13 35±3 137±13 258±12 34±3+S9 138±12 38±3 143±12 261±11 36±3 40 μg/皿 -S9 124±9 33±3 140±14 265±11 40±4+S9 132±9 40±4 147±12 255±10 37±3 8 μg/皿 -S9 125±8 36±2 143±8 264±9 35±3+S9 141±9 37±4 143±15 263±12 38±4給藥組

3.2 細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)

在代謝和非代謝活化條件下，陽性對照組細(xì)胞畸變率與陰性對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。各受試藥品組細(xì)胞畸變率與陰性對照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），各劑量組畸變率未呈現(xiàn)劑量反應(yīng)關(guān)系，表明受試藥物在250～1000 μg/ml劑量范圍內(nèi)，CHL細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)結(jié)果為陰性，見表3。

表3 小兒牛黃清心散CHL細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)結(jié)果

3.3 微核試驗(yàn)結(jié)果

小兒牛黃清心散給藥組與陰性對照組相比，PCE/（NCE+PCE）差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），陽性對照組與陰性對照組相比，PCE/（NCE+PCE）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明小兒牛黃清心散對骨髓細(xì)胞的造血功能沒有產(chǎn)生抑制意義（P＞0.05），陽性對照組骨髓微核發(fā)生率與陰性對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表4。

表4 小兒牛黃清心散對小鼠骨髓細(xì)胞微核率的影響

4 討論

經(jīng)細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，受試菌株TA100在小兒牛黃清心散作用濃度達(dá)最大劑量5000 μg/皿時(shí)，細(xì)菌回變菌落數(shù)無明顯減少，各劑量組與陰性對照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明小兒牛黃清心散在5000 μg/皿及以下劑量對試驗(yàn)菌株無毒性作用。因此，正式試驗(yàn)時(shí)選用最高劑量5000 μg/皿，其余劑量按指導(dǎo)原則要求分別設(shè)定為1000，200，40，8 μg/皿。

在進(jìn)行染色體畸變試驗(yàn)時(shí)，由于細(xì)胞培養(yǎng)所用培養(yǎng)基一般對熱敏感，因此可將小兒牛黃清心散預(yù)先滅菌處理后，再用DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行配制。本品在濃度較高時(shí)，如5 mg/ml濃度時(shí)對CHL細(xì)胞未顯示出細(xì)胞毒性，但易沉淀在培養(yǎng)瓶底部影響細(xì)胞生長和細(xì)胞狀態(tài)觀察，并對后續(xù)染色體試驗(yàn)產(chǎn)生影響，因此根據(jù)指導(dǎo)原則要求，本研究試驗(yàn)最高劑量選用1 mg/ml，試驗(yàn)可操作性和結(jié)果良好。

急性毒性試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，小兒牛黃清心散對嚙齒類動(dòng)物毒性低，急性毒性未求出LD50。根據(jù)藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則，我們在小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)中，試驗(yàn)最高劑量設(shè)為2000 mg/kg BW，中、低劑量組設(shè)定為1000，500 mg/kg BW。

根據(jù)3項(xiàng)遺傳毒性試驗(yàn)結(jié)果，可認(rèn)為小兒牛黃清心散在本試驗(yàn)劑量范圍內(nèi)未見遺傳毒性作用。