一種全新結(jié)構(gòu)PDE-5抑制劑的成藥性研究

黃艷妮，房紹英，劉 純，鄭曉霞，何小華，張洪坤，程艷玲*

（1.山東省藥學(xué)科學(xué)院 山東省化學(xué)藥物重點實驗室，山東 濟南 250101；2.山東商業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山東 濟南 250101）

勃起功能障礙（erectile dysfunction，ED）是指在過去的3個月中，陰莖持續(xù)不能達到或維持足夠的勃起以進行滿意的性交[1]，是男科常見的一種疾病。有研究表明，全球約有1.5億的男性患有不同程度的ED，其中40歲以上男性發(fā)病率約為40 %，且隨著年齡的增加ED發(fā)病率逐年升高，在超過70歲的男性中，ED的發(fā)生率為75 %[2]。ED的發(fā)生不僅與年齡有關(guān)，還與心理因素、手術(shù)創(chuàng)傷、生活習(xí)慣及心血管疾病等直接相關(guān)[3]。ED的產(chǎn)生會嚴重影響患者及伴侶的身體及心理健康，給家庭和社會帶來沉重負擔(dān)。

目前治療ED的藥物包括以下幾類：5型磷酸二酯酶抑制劑（PDE-5）、平滑肌松弛藥物、α-腎上腺素能受體抑制劑、5-羥色胺受體抑制劑、激素類藥物、中藥等[4]。在這些藥物中，PDE-5抑制劑是治療ED的一線藥物，可用于各種原因?qū)е碌腅D，其安全性和有效性在臨床上得到廣泛認可，已上市的PDE-5抑制劑類藥物包括西地那非、他達拉非、伐地那非、阿伐那非、優(yōu)地那非和米羅那非等7個藥物[5-6]。

PDE-5抑制劑臨床應(yīng)用過程中，仍存在一些有效性及安全性問題，有研究發(fā)現(xiàn)[7]，有約20 %的患者對PDE-5抑制劑無應(yīng)答，且西地那非及伐地那非對PDE-6的選擇性較差，臨床使用過程中患者會出現(xiàn)視覺障礙的不良反應(yīng)；他達拉非解決了對PDE-6的選擇性問題，但對PDE-11有一定的抑制作用，臨床使用過程中可能出現(xiàn)背痛癥狀，因此研發(fā)全新結(jié)構(gòu)的新型PDE-5抑制劑用于治療ED，具有重要的臨床意義及社會意義。

1 儀器與材料

1.1 儀器

數(shù)顯游標(biāo)卡尺（桂林廣陸數(shù)字測控公司）；Scout SE型電子天平（奧豪斯公司）；Thermo Fisher Ultimate 3000高效液相色譜儀（美國賽默飛世爾科技公司）；API4500三重四級桿質(zhì)譜儀（ABSCIEX中國公司）；Eppendorf移液器（德國艾本德公司）；AUW-120D型電子分析天平（日本島津公司）；MS3型漩渦混懸器（IKA公司）；Z216MK高速冷凍離心機（德國哈默股份公司）；Milli-Q Advantage A10超純水儀[默克化學(xué)技術(shù)（上海）公司]；EZ Reader Ⅱ酶標(biāo)儀（Caliper公司）。

1.2 材料與試劑

化合物1（山東康邁祺，批號：PU-170617，純度：99.67 %）；枸櫞酸西地那非（Maya-R提供，批號：MAYA-CR-1138，純度：99.5 %）；羧甲基纖維素鈉（上海滬試實驗室器材公司，批號：F20110211）；PDE5A1（BPS，批號：60050）；PDE6C（BPS，批號：60062）；PDE11A4（BPS，批號：60110）；384孔板（Perkin Elmer，批號：6007279）；格列吡嗪（中國食品藥品檢定研究院，批號：100281-201203，含量：99.5 %）；甲醇[賽默飛世爾科技（中國）公司，色譜純，批號：140400]；甲酸[賽默飛世爾科技（中國）公司，批號：163701]；乙腈[賽默飛世爾科技（中國）公司，色譜純，批號：151296]；肝素鈉注射液（山東魯抗辰欣藥業(yè)，批號：1609286421）。

1.3 實驗動物

KM小鼠，80只，雄性，體重18.1～25.2 g。SD大鼠，27只，雄性，體重220～270 g，大、小鼠均由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（魯）20140007。大、小鼠均飼養(yǎng)于萬級屏障環(huán)境中，按GB/16886.2動物的福利要求規(guī)范進行管理，室溫控制為20～25 ℃，相對濕度控制為40 %～70 %，晝夜明暗交替時間12 h/12 h。動物使用許可證號：SCXK（魯）20140008。

新西蘭兔，24只，雄性，體重為2.0～2.5 kg，由濟南西嶺角養(yǎng)殖繁育中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（魯）20150001。普通環(huán)境中飼養(yǎng)，每籠1只，室溫19～26 ℃，溫差≤4 ℃，換氣次數(shù)8～10次/h，晝夜明暗交替時間12 h/12 h。動物使用許可證號：SCXK（魯）20140008。

2 方法

2.1 化合物1對PDE-5A1，PDE-6C及PDE-11A4的體外抑制作用

準確稱取化合物1，加入DMSO充分溶解，配置成10 mmol/L母液保存。試驗時稀釋為所需濃度，最高濃度為10 μmol/L，然后依次4倍稀釋。體外酶活性檢測方法如下：在96孔板中加入20 μl底物[10 μmol/L熒光素標(biāo)記的環(huán)-磷鳥苷（FL-cGMP） ]，化合物1溶液1 μl，1.38 ng/μl酶緩沖液[緩沖液由100 mmol/L羥乙基哌嗪乙硫磺酸（pH 7.5），5 mmol/L MgCl2和0.002 %月桂醇聚氧乙烯醚組成]29 μl。30 ℃孵育1 h，加入 70 μmol/L EDTA 20 μl終止反應(yīng)，每孔轉(zhuǎn)移反應(yīng)液26 μl至384孔板，EZ Reader II酶標(biāo)儀檢測讀數(shù)，計算抑制率，Prism 5.0軟件計算半數(shù)抑制濃度（IC50）。抑制率＝（轉(zhuǎn)化率ZEP-轉(zhuǎn)化率樣品）/（轉(zhuǎn)化率ZEP-轉(zhuǎn)化率HEP）×100 %，式中轉(zhuǎn)化率ZEP為不加化合物1的空白對照組的熒光值，轉(zhuǎn)化率樣品為加化合物1樣本的熒光值，轉(zhuǎn)化率HEP為不加酶的空白對照的熒光值。

2.2 化合物1對正常家兔陰莖勃起功能的影響[8-9]

取雄性新西蘭兔24只，適應(yīng)1周后開始試驗，試驗時按體重隨機分為4組，分別為西地那非組（劑量2.3 mg/kg）、化合物1高、中、低劑量（2.3，1.15，0.06 mg/kg）組，每組6只。開始試驗前每天捉拿家兔，讓家兔習(xí)慣反復(fù)的捉拿操作后開始給藥刺激。各給藥組灌胃給予相應(yīng)的藥物溶液5 ml/kg，灌胃給藥前及給藥后5，15，30，60，120，240，300 min分別用數(shù)顯游標(biāo)卡尺測兔陰莖長度，每次測量過程中避免卡尺觸碰陰莖。根據(jù)各時間點陰莖長度及時間，繪制長度-時間曲線，并計算曲線下面積（AUC）。

2.3 化合物1 SD大鼠體內(nèi)藥動學(xué)研究

取雄性SD大鼠22只，適應(yīng)1周后開始試驗，試驗時按體重隨機分為4組，分別為化合物1靜注組（劑量4.5 mg/kg）、化合物1口服高、中、低劑量（9，4.5，2.25 mg/kg）組，每組5～6只。禁食不禁水約12 h后，各組灌胃或靜脈注射給予相應(yīng)的藥物溶液10 ml/kg。各組大鼠給藥前眼眥采血，靜注組于藥后0.25，0.5，1，1.5，2，4，6，8，10，12，24 h 眼眥采血，口服組于藥后0.5，1，2，4，6，7，8，10，12，14，24，30 h眼眥采血。采血約0.5 ml，置入肝素鈉抗凝的離心管，4 ℃ 10 000 r/min離心5 min，制備血漿。血漿樣品采用高效液相質(zhì)譜-串聯(lián)色譜（LC/MS/MS） 分析，梯度洗脫，MS檢測離子對：化合物1（m/z470.9/371.1），格列吡嗪（內(nèi)標(biāo)，m/z446.2/321.0）。利用DAS3.2.6軟件計算藥動學(xué)參數(shù)，以AUC0-∞計算化合物1的生物利用度。

2.4 化合物1大鼠血漿蛋白結(jié)合率研究

2.4.1 樣本采集方法 取雄性SD大鼠5只，適應(yīng)1周后開始試驗，大鼠禁食不禁水12 h后，尾靜脈注射給予4.5 mg/kg化合物溶液。于藥后0.25，0.5，1 h眼眥采血，采血約0.5 ml，置入肝素鈉抗凝的離心管，4 ℃ 10 000 r/min 離心5 min，制備血漿。取血漿100 μl于超濾離心管中，8 ℃、13 000 r/min離心30 min，收集濾液，其余血漿用于測定總藥物濃度。

2.4.2 吸附率測定 配制濃度為30，150，300 ng/ml的化合物的20 %乙腈溶液，取100 μl，置入超濾離心管，8 ℃、13 000 r/min離心30 min，收集濾液。測定超濾前（ρpre）及超濾后（ρpost）化合物1濃度，根據(jù)以下公式計算藥物非特異性結(jié)合吸附率（NSB）。

NSB=（ρpre-ρpost）/ρpre×100 %。

2.4.3 血漿蛋白結(jié)合率計算 分別取20 μl未經(jīng)超濾血漿、超濾后血漿樣本置入1.5 ml離心管，加入內(nèi)標(biāo)乙腈溶液（格列吡嗪濃度200 ng/ml）180 μl，渦旋2 min，12 000 r/min（15 ℃）離心5 min，取上清，進樣2 μl檢測。根據(jù)公式F=(A-B)/A計算大鼠體內(nèi)血漿蛋白結(jié)合率，其中A為總藥物濃度，B為游離藥物濃度。

2.5 化合物1小鼠急性毒性初步研究[10]

取雄性KM小鼠80只，適應(yīng)3 d后開始試驗，試驗時按體重隨機分為8組，分別為西地那非不同劑量（758.4，568.8，426.7，320 mg/kg）組、化合物1不同劑量（21.8，19.3，14.5，10.9 g/kg）組，每組10只，禁食不禁水12 h后，各組小鼠灌胃給藥1次，給藥體積為40 ml/kg，給藥后觀察4 h，之后每天上、下午觀察并記錄小鼠的一般活動、行為、體重及死亡情況，共觀察14 d，計算半數(shù)致死量（LD50）。

2.6 統(tǒng)計分析

3 結(jié)果

3.1 化合物1對PDE-5A1，PDE-6C及PDE-11A4的體外抑制作用

化合物1對PDE-5A1的IC50為0.17 nmol/L，而西地那非對PDE-5A1的IC50為5.38 nmol/L，提示化合物1對PDE5A1的抑制活性優(yōu)于西地那非。化合物1對PDE-6和PDE-11的抑制活性與西地那非相近。見表1。

表1 化合物1對PDE-5A1、PDE-6C及PDE-11A4的IC50值/nmol·L-1

3.2 化合物1對正常家兔陰莖勃起功能的作用

化合物1對正常家兔陰莖勃起功能的作用見圖1。由圖1可見，化合物1劑量為0.6 mg/kg時對家兔陰莖勃起沒有促進作用，劑量為1.15，2.3 mg/kg時可明顯促進家兔陰莖勃起。此外，化合物1在給藥后15 min起效，在該模型中的最低起效劑量為1.15 mg/kg，維持時間為2 h左右，與西地那非相近。經(jīng)計算，化合物1與西地那非在劑量為2.3 mg/kg時AUC分別為379.8，183.8 mm·min，兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），進一步的比較需放大樣本進行。

圖1 化合物1在不同劑量下對正常家兔陰莖勃起功能的作用

3.3 化合物1 SD大鼠體內(nèi)藥動學(xué)研究

化合物1 SD大鼠中體內(nèi)藥動學(xué)參數(shù)見表2，血藥濃度-時間曲線（C-T曲線）見圖2、圖3。由表2可見，化合物1口服給藥劑量為2.25～9 mg/kg時Cmax、AUC0-t、AUC0-∞隨劑量增加呈線性遞增趨勢，說明化合物1在SD大鼠中呈線性藥動學(xué)特征。

相同劑量下，相比于靜注給藥組，化合物1口服給藥組暴露量低（Cmax、AUC0-t、AUC0-∞均低于靜注組，P＜0.05）。同時，口服組表觀分布容積（Vd）和清除率（CL）均高于靜注組（P＜0.05），說明口服途徑化合物1分布廣，清除速率高。經(jīng)計算，化合物1的生物利用度（F）值為13.63 %。

表2 化合物1在SD大鼠中的藥動學(xué)參數(shù)

圖2 SD大鼠分別灌胃給予低、中、高劑量化合物1后，平均血藥濃度-時間曲線（n=6，5，5）

圖3 SD大鼠靜脈給予化合物1后，平均血藥濃度-時間曲線（n=6）

3.4 化合物1大鼠血漿蛋白結(jié)合率研究

根據(jù)超濾膜非特異性結(jié)合（NSB）公式：NSB/%=（ρpre-ρpost）/ρpre×100 % 計算得藥物吸附率為-9.41 %～2.99 %，表明超濾膜對藥物不存在非特異性結(jié)合，可采用超濾法測定血漿蛋白結(jié)合率。經(jīng)過進一步測試，化合物1的血漿蛋白結(jié)合率為99.97 %，見表3。

表3 化合物1血漿蛋白結(jié)合率

3.5 化合物1小鼠急性毒性初步研究

化合物1小鼠急性毒性初步研究結(jié)果表明：化合物1與西地那非出現(xiàn)的毒性反應(yīng)相似，表現(xiàn)為消瘦、活動減少、體重增長緩慢等癥狀；死亡時間集中于給藥后第6～9天，死亡動物主要臟器（腦、心、肝、脾、肺、腎）未見其他明顯異常?；衔?灌胃給藥的 LD50為14.8 g/kg，西地那非的LD50為580.6mg/kg。

4 討論

ED是成年男子常見的一種疾病，隨著我國老齡化的加劇，ED的發(fā)生呈明顯的上升趨勢。在40～70歲的男性中，ED的發(fā)生率高達50 %以上，雖然患病率居高，但去正規(guī)醫(yī)院診治的患者低于10 %[11]。正常的陰莖勃起是血管、神經(jīng)、激素、海綿體多種因素共同參與，其中任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題均可導(dǎo)致ED的發(fā)生。

在陰莖勃起的生理過程中，NO發(fā)揮著重要作用，當(dāng)陰莖海綿體中的NO濃度增加時，直接激活鳥苷酸環(huán)化酶，從而促使第二信使環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）的濃度增加，繼而引起細胞內(nèi)Ca2+濃度下降，平滑肌舒張，陰莖海綿體膨脹，體積增大，從而導(dǎo)致海綿體的白膜拉伸延長，白膜下靜脈壓迫變窄，靜脈回流受阻，陰莖勃起，而當(dāng)cGMP被PDE5降解時，cGMP濃度降低，從而不能引起陰莖勃起[12-13]。因此特異性阻斷PDE5的藥物可提高陰經(jīng)海綿體內(nèi)cGMP的濃度，用于治療勃起功能障礙。

PDE家族有PDE-1～PDE-11 11個成員，在人體腦、心、肺、血管等部位分布廣泛。PDE具有不同的底物專一性，其中，PDE-5，6，9特異性地選擇作用于cGMP，PDE4，7，8選擇性作用于環(huán)磷酸腺苷（cAMP），其他的PDE則對cAMP和cGMP均起作用[14]。參考已上市的PDE-5抑制劑藥物文獻[15]，在藥物篩選階段，我們重點考察藥物對3個酶的抑制性，即PDE-5，PDE-6和PDE-11。其中PDE-5與藥物的作用機制直接相關(guān)，而對PDE-6，PDE-11的抑制可能與藥物的不良反應(yīng)有關(guān)，PDE-6可能與視物模糊有關(guān)，PDE-11則可能與背痛和肌肉酸痛有關(guān)。在上市的PDE-5抑制劑類藥物中，西地那非、伐地那非、優(yōu)地那非、米羅那非和羅地那非對PDE-6的選擇性較差；他達拉非對PDE-6的選擇性較好，但其對PDE-11的選擇性較差，但半衰期較長；而新一代的阿伐那非對PDE-6，11的選擇性均好，但半衰期較短。

化合物1是山東康邁祺公司自主研發(fā)的1.1類創(chuàng)新藥?；衔?對PDE-5A1的體外抑制作用優(yōu)于西地那非，IC50為西地那非的1/31；化合物1在1.15～2.3 mg/kg劑量下可劑量依賴性地促進正常家兔陰莖勃起，同時在2.3 mg/mg劑量下，即西地那非的臨床等效劑量，化合物1促進家兔勃起的作用略強于西地那非；化合物1具有較好的藥動學(xué)性質(zhì)，清除率較低，半衰期較長，可達3.9～12.42 h；化合物1的大鼠血漿蛋白結(jié)合率為99.97 %，屬于高血漿蛋白結(jié)合率藥物；小鼠急性毒性試驗中，化合物1毒性明顯低于西地那非?？傊?，化合物1具有較好的體內(nèi)、外活性，對PDE-6及PDE-11具有較好的選擇性，安全性較高，具有良好的成藥性，值得進一步研究。