秉前環(huán)毛蚓蚓激酶的提取及活性研究初報(bào)

林佳艷　王文文　唐梅

摘? ?要? ?蚓激酶是從蚯蚓體內(nèi)提取的一組具有激酶和纖溶酶活性的蛋白質(zhì)，能夠溶解血栓，具有很好的臨床應(yīng)用價(jià)值。試驗(yàn)采用硫酸銨粗提取的方法，從峨眉山大蚯蚓（秉前環(huán)毛蚓）體內(nèi)提取蚓激酶粗提取物，測(cè)定其生物活性，并探討pH值、金屬離子及溫度對(duì)粗提物酶活性的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明：1）pH值、金屬離子及溫度對(duì)粗提物酶活性有影響。2）pH值在5～12，蚓激酶活性相對(duì)比較穩(wěn)定，當(dāng)pH=8時(shí)，酶活性達(dá)到最大值;3）Pb2+、Hg2+抑制酶活性;K+、Ca2+和Fe2+促進(jìn)酶活性;4）當(dāng)溫度在60 ℃以下時(shí)，酶活性較高且穩(wěn)定性好;大于80 ℃時(shí)幾乎完全失活。

關(guān)鍵詞? ?峨眉山大蚯蚓;秉前環(huán)毛蚓;蚓激酶;酶活性;纖溶酶

中圖分類號(hào)：Q814? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2019.19.017

蚯蚓，又名地龍，屬環(huán)節(jié)動(dòng)物門寡毛綱[1]。世界上蚯蚓大約有2 500種，入藥史長(zhǎng)達(dá)四千年之久[2]。在中國(guó)醫(yī)藥學(xué)歷史上，蚯蚓可作為傳統(tǒng)中藥，具有降壓、利尿、清熱等作用。蚯蚓除作為傳統(tǒng)中藥外，還可從其體內(nèi)提取活性物質(zhì)，如蚓激酶、多種氨基酸等[3]。蚯蚓喜歡在潮濕陰暗、較疏松及腐殖質(zhì)多的土壤中營(yíng)穴居生活，通常晝伏夜出，能夠有效地躲避天敵[4]。

日本美原恒等從粉正蚓（Lumbricus rubellus）體內(nèi)分離出一種具有溶纖作用的粗提物，并命名為蚓激酶[5]。蚓激酶具有激酶和纖溶酶活性，有溶解血栓作用，是目前世界上極具開發(fā)價(jià)值的纖溶類藥物。程牛亮[6]分離得到相對(duì)分子質(zhì)量為36 000和29 000的兩種纖溶酶組分，能夠較好地溶解纖維蛋白及家兔血凝塊。鄧國(guó)寶等[7]發(fā)現(xiàn)蚓激酶具有良好的降低血糖、血脂功能。董強(qiáng)等[8]發(fā)現(xiàn)蚓激酶可用來(lái)治療和預(yù)防缺血性腦血管疾病。

峨眉山大蚯蚓，學(xué)名為秉前環(huán)毛蚓（Pheretima praepinguis），是峨眉山的特有種，主要分布在峨眉山的龍門洞（海拔約600 m）至萬(wàn)年寺（海拔約1 000 m）[4]。峨眉山大蚯蚓肌肉很發(fā)達(dá)，伸縮能力強(qiáng)，可有效改善和凈化土壤。本試驗(yàn)從峨眉山大蚯蚓體內(nèi)提取蚓激酶粗提物，測(cè)定其生物活性，并探討pH值、金屬離子及溫度對(duì)粗提物酶活性的影響，為研發(fā)蚓激酶類藥物提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為峨眉山大蚯蚓（秉前環(huán)毛蚓），2017年7月在峨眉山報(bào)國(guó)寺、清音閣、萬(wàn)年寺和洪椿坪一帶（海拔500～1 200 m）采得。峨眉山大蚯蚓先進(jìn)行粗提，蚓激酶粗提物置-4 ℃恒溫箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蚓激酶粗提物的提取

提取蚓激酶工藝流程為[9]：原材料蚯蚓→多次水洗→稱重量→加入緩沖溶液→勻漿機(jī)勻漿→離心→取上清液加入硫酸銨→離心→上清液加入硫酸銨→高速離心→收集沉淀→透析去掉鹽→冷凍干燥凍干→蚯蚓粗制品。

1.2.2 蚓激酶粗提物濃度測(cè)定

測(cè)定蚓激酶粗提物濃度，采用考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定蚓激酶溶液在波長(zhǎng)為595 nm下測(cè)定其吸光度值[10]，得出濃度。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.006 9x+0.002 1，系數(shù)R2=0.988 3。詳見圖1。

1.2.3 蚓激酶粗提物的活性測(cè)定

蚓激酶粗提物活性的測(cè)定采用酶解雞血塊方法[11]。

1.2.4 蚓激酶粗提物pH穩(wěn)定性測(cè)定及最適pH值

蚓激酶粗提物pH穩(wěn)定性測(cè)定及最適pH值參考周海等的方法[12]。

1.2.5 測(cè)定各種金屬離子對(duì)蚓激酶粗提物活性的影響

測(cè)定各種金屬離子對(duì)蚓激酶粗提物活性的影響參考謝德芳的方法[2]。

1.2.6 蚓激酶粗提物熱穩(wěn)定性以及最適溫度的測(cè)定

蚓激酶粗提物熱穩(wěn)定性以及最適溫度的測(cè)定參考鄧志會(huì)的方法[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 蚓激酶粗提物的制備

本試驗(yàn)新鮮峨眉山大蚯蚓的總用量為875.65 g，通過(guò)鹽析粗提、透析去鹽、冷凍干燥后得到蚓激酶粗提物7.18 g，蚓激酶的產(chǎn)率為0.82%，蚓激酶產(chǎn)率較低。由圖1可知，取1 mL蚓激酶液進(jìn)行測(cè)定，得到吸光度值為0.365，由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程可知蚓激酶液的濃度為52.6 μg·mL-1。

2.2 蚓激酶粗提物酶活性的檢測(cè)

由表1可知，第3組上清液蛋白質(zhì)含量較第一、二組含量高。在雞血塊被酶解后，所含可溶性蛋白質(zhì)含量明顯提高，由0.24%上升到0.62%。由此可知，蚓激酶粗提物具有酶活性，能夠酶解雞血塊使其蛋白含量增加。

2.3 蚓激酶粗提物的pH穩(wěn)定性測(cè)定

混合液放置一段時(shí)間，進(jìn)行活性測(cè)定，結(jié)果如圖2所示。當(dāng)pH<3時(shí)，蚓激酶幾乎失去活性;在pH在5～12，蚓激酶活性相對(duì)比較穩(wěn)定;在pH=8時(shí)，酶活性達(dá)到最大值;雖然在pH>9后，酶活性雖有所下降，但其活性相對(duì)仍較高;可見，蚓激酶在堿性環(huán)境，其活性相對(duì)較強(qiáng)。

2.4 金屬離子對(duì)蚓激酶的活性影響

由圖3可知，K+、Ca2+和Fe2+能夠提高蚓激酶活力;而Pb2+和Hg2+對(duì)酶活有抑制作用。金屬離子作為酶的激活劑還是抑制劑，主要取決于金屬離子與酶活性中心基團(tuán)是否發(fā)生作用。若某一金屬離子能與酶某一活性中心基團(tuán)作用結(jié)合，抑制酶發(fā)揮正常作用，如重金屬離子Pb2+、Hg2+就可以和酶活性中心的-SH作用而抑制酶活性。金屬離子如K+、Ca2+和Fe2+等對(duì)酶活性就起促進(jìn)作用。

2.5 蚓激酶粗提物的熱穩(wěn)定性及最適溫度的測(cè)定

將蚓激酶粗提物放在不同溫度水浴鍋保溫2 h后，測(cè)定蚓激酶活性。如圖4所示，蚓激酶粗提物在溫度60 ℃以下保溫2 h，其酶活性相對(duì)穩(wěn)定，沒(méi)有顯著變化;但溫度高于60 ℃，蚓激酶活性發(fā)生變化，曲線呈下降趨勢(shì)，且斜率相對(duì)較大，說(shuō)明酶活性下降速率較快;當(dāng)溫度達(dá)到80 ℃以上時(shí)，蚓激酶幾乎完全失去活性。由此可知，蚓激酶具有很好的溫度穩(wěn)定性，可以在常溫下進(jìn)行提取和儲(chǔ)存。

3 結(jié)論與討論

遲玉杰等[14]研究表明，蚓激酶在pH=8.0時(shí)的活性最高。蚓激酶的最適溫度為57 ℃，熱穩(wěn)定性好;蚓激酶其化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，強(qiáng)酸強(qiáng)堿能夠破壞蛋白質(zhì)的穩(wěn)定，使得蚓激酶失去了生物活性。

由試驗(yàn)可知，在偏堿性條件下，蚓激酶的活性相對(duì)較強(qiáng)，pH值在5～12時(shí)，蚓激酶的活性都較強(qiáng);pH=8.0時(shí)，蚓激酶的活性最高;pH<3蚓激酶幾乎完全失去活性?？梢姡炯っ妇哂休^好的pH穩(wěn)定性，能夠較好地適應(yīng)堿性環(huán)境，如腸道堿性環(huán)境。若將蚓激酶加工成腸制劑，蚓激酶在腸道中可以保持較高的活性，發(fā)揮作用時(shí)間長(zhǎng)，但是如果位于胃液較強(qiáng)酸性（pH值一般在0.9～1.5）環(huán)境中，蚓激酶失去活性，不能正常發(fā)揮作用。

金屬離子對(duì)蚓激酶的作用有所差別，K+、Ca2+和Fe2+能夠增強(qiáng)蚓激酶活力，起著激活劑作用;而Pb2+和Hg2+抑制酶活性，起著抑制劑作用，與遲玉杰等[14]研究結(jié)果相似。

劉美艷等[15]研究證明，在蚓激酶活性不被破壞的條件下，通過(guò)較長(zhǎng)時(shí)間水浴保溫，蚓激酶活性仍能保持在50%以上。本試驗(yàn)也表明蚓激酶粗提物的熱穩(wěn)定性比較強(qiáng)，能夠較好的適應(yīng)溫度的變化。因此，蚓激酶藥劑在室溫下能儲(chǔ)存。

蚓激酶有溶解血栓和防止血栓形成等作用，其應(yīng)用前景廣闊，直接從蚯蚓中提取蚓激酶，量少且花費(fèi)大，目前蚓激酶還沒(méi)有基因工程產(chǎn)品，后期可以利用基因工程技術(shù)進(jìn)行蚓激酶基因的轉(zhuǎn)移及表達(dá)研究;為進(jìn)一步研究純化、研究構(gòu)效的關(guān)系，在增強(qiáng)或保持其催化活性的前提下通過(guò)對(duì)其某些特定氨基酸殘基的突變或是通過(guò)相關(guān)結(jié)構(gòu)域的刪除、增加或融合等手段，以期提高對(duì)纖維蛋白的選擇性、提高對(duì)纖溶酶原激活劑、抑制劑的抗性，延長(zhǎng)其在血液循環(huán)中的半衰期，導(dǎo)向溶栓、抗血栓形成等是今后蚓激酶的研究方向;同時(shí)為后期蚓激酶的開發(fā)和批量生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：敬廷桃）