氮磷鉀配施比例對曬紅煙碳氮代謝關(guān)鍵酶活性及化學(xué)成分的影響

郭濛濛　邱寶平　符云鵬　郭世英　孟莉　郭連民　趙曉軍　韓富根

摘要：為探討氮用量及氮磷鉀配施比例對曬紅煙碳氮代謝關(guān)鍵酶活性及化學(xué)成分的影響，以曬紅煙品種大葉黃為材料，測定各處理下不同生育期轉(zhuǎn)化酶（INV）、淀粉酶（AM）、谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸脫氫酶（GDH）的活性。結(jié)果表明：在碳代謝的過程中，低氮處理的INV活性主要在煙葉生長中期起作用，增施氮肥可促使其作用時間提前，N：P2O5在1：（0.5～1.0）內(nèi)增施磷肥能增強INV的活性。各處理的AM活性在煙葉生長中期起作用，增施氮肥能促使煙葉成熟期淀粉酶活性減弱。在氮代謝過程中，GS活性主要在生長前期起作用；在煙葉成熟期，中氮水平下Gs活性較強。GDH活性主要在生長后期起作用，煙葉成熟期的GDH活性在高氮水平下最強，且在同一氮水平下以中鉀水平處理活性較強；曬后煙葉的化學(xué)成分在中氮中磷高鉀處理下較協(xié)調(diào)。

關(guān)鍵詞：曬紅煙；氮用量；氮磷鉀配施比例；碳氮代謝；化學(xué)成分；酶活性

中圖分類號：S572.06文獻標志碼：A文章編號：1002-1302（2015）05-0095-03

碳氮代謝是煙株最基本的生理代謝過程，其代謝強度及在生長發(fā)育過程中的動態(tài)變化對煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)形成具有重大的影響。氮、磷、鉀是煙草正常生長發(fā)育所必需的大量營養(yǎng)元素，對碳氮代謝過程中各種關(guān)鍵酶活性的變化起決定性的調(diào)節(jié)作用。有研究表明，在煙草碳氮代謝中，施氮量直接關(guān)系到硝酸還原及整個氮代謝的強度，適當(dāng)增施氮素對烤煙光合作用中碳固定代謝具有顯著的促進作用；施磷量對煙葉中后期淀粉酶活性有影響，增施磷肥可以明顯提高烤煙淀粉酶的活性，使碳代謝能力增強；鉀素作為某些酶的催化劑，能直接參與烤煙的碳氮代謝和多種物質(zhì)的合成與運輸，增強烤煙的抗逆性，改善煙葉的燃燒性，還與煙葉吃味、香味、香氣量有關(guān)。適宜的氮磷鉀配施比例（簡稱配比）可協(xié)調(diào)煙葉的內(nèi)在化學(xué)成分，顯著提高煙葉品質(zhì)。吉林省是我國主要的曬煙產(chǎn)區(qū)之一，目前仍有相當(dāng)部分產(chǎn)地曬煙采用傳統(tǒng)生產(chǎn)方式，不重視養(yǎng)分的平衡供應(yīng)，缺鉀現(xiàn)象普遍，煙葉鉀含量低、燃燒虛弱。本試驗研究氮用量及氮磷鉀配比對曬紅煙生長發(fā)育過程中碳氮代謝關(guān)鍵酶活性及化學(xué)成分的影響，為指導(dǎo)曬紅煙合理施肥、提高煙葉品質(zhì)提供科學(xué)依據(jù)。

1.材料與方法

1.1試驗材料

試驗于2013年在吉林省農(nóng)安縣青山口鄉(xiāng)青山口村進行。供試曬紅煙品種為大葉黃，試驗地土壤為油沙土，含有機質(zhì)12.70g/kg、堿解氮142mg/kg、速效磷19.89mg/kg、速效鉀243.54mg/kg，pH值5.52。

1.2試驗設(shè)計

試驗設(shè)氮磷鉀3因素3水平，氮水平分別為45kg/hm²（N1）、67.5kg/hm²（N2）、90kg/hm²（N3）；磷水平即N：P203分別為1：0.5（P1）、1：1.0（P2）、1：1.5（P3）；鉀水平即N：K20分別為1：1（K1）、1：2（K2）、1：3（K3），共形成9個處理組合（表1），采用L9。（3⁴）正交試驗，隨機區(qū)組排列，3次重復(fù)，小區(qū)面積為200m²。試驗所用肥料為煙草專用復(fù)合肥（N、P2O5、K2O含量分別為10%、12%、22%）、硝酸銨磷、磷二銨、硫酸鉀等，基追肥比例為8：2。行株距分別為120、50cm，其他栽培管理方式按當(dāng)?shù)刈顑?yōu)措施實施。

1.3樣品的采集與制備

各處理選擇生長一致的煙株取中部葉（9～10位葉）進行研究，分別在10、20、30、40、50、60葉齡時取樣，每張葉片取中間部位去除主側(cè)脈，混合后立即用液氮冷凍，在-80℃冰箱中保存，用于煙葉碳氮代謝關(guān)鍵酶活性的測定。同樣部位調(diào)制后的煙葉用于測定其化學(xué)成分。

1.4指標的測定與方法

1.4.1碳氮代謝關(guān)鍵酶轉(zhuǎn)化酶（INV）活性采用3，5一二硝基水楊酸比色法測定；淀粉酶活性按照文獻[6]的方法測定；谷氨酰胺合成酶（Gs）活性測定參照郝再彬等的方法；谷氨酸脫氫酶（GDH）活性測定參照Turano等的方法，在340min處測定30s內(nèi)吸光度的變化，以1min反應(yīng)混合液于30℃減少1bunol的NADH定義為1個酶活性單位，GDH活性以1min內(nèi)1mg蛋白催化NADH減少的量（μmol）表示。

1.4.2主要化學(xué)成分按照YC/T159-2002《煙草及煙草制品水溶性糖的測定連續(xù)流動法》、YC/T160-2002《煙草及煙草制品

總植物堿的測定

連續(xù)流動法》、YC/T161-2002《煙草及煙草制品

總氮的測定

連續(xù)流動法》、YC/T217-2007《煙草及煙草制品

鉀的測定

連續(xù)流動法》、YC/T162-2002《煙草及煙草制品氯的測定連續(xù)流動法》測定煙葉中總糖、還原糖、煙堿、總氮、鉀和氯的含量，所用儀器為德國布朗盧比公司制造的AA3型流動分析儀。

1.5數(shù)據(jù)處理

利用Excel2007和SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2.結(jié)果與分析

2.1不同處理對曬紅煙生長發(fā)育過程中碳氮代謝關(guān)鍵酶活性的影響

2.1.1轉(zhuǎn)化酶（INV）

轉(zhuǎn)化酶與植物的碳代謝密切相關(guān)，可催化細胞質(zhì)中蔗糖轉(zhuǎn)化成單糖，促進葉綠體內(nèi)磷酸丙糖向外運轉(zhuǎn)，使葉綠體中的淀粉積累量減少，并通過與呼吸作用偶聯(lián)的氧化磷酸化產(chǎn)生能量，使光合碳固定過程加強。轉(zhuǎn)化酶反映了煙葉對光合產(chǎn)物的利用程度，是碳代謝強弱的重要標志。由表2可知，在煙葉生長發(fā)育過程中不同處理的轉(zhuǎn)化酶活性均呈現(xiàn)出先增強后減弱的趨勢。N1水平下的活性高峰出現(xiàn)在30葉齡時，N2、N3水平下的活性高峰出現(xiàn)在20葉齡時，且N1水平下的活性高峰值高于N2、N3水平，在20葉齡時各處理間差異不顯著，說明增施氮肥不能增強轉(zhuǎn)化酶的活性而會促使其活性高峰期提前、下降時間前移。在代謝旺盛時期，同一氮水平下，P2水平下的煙葉轉(zhuǎn)化酶活性最強；在60葉齡時，各處理轉(zhuǎn)化酶活性差異不顯著。說明在煙葉生長前期，P2處理能增強煙葉轉(zhuǎn)化酶的活性，有利于糖類物質(zhì)的外運，加強體內(nèi)代謝，促進葉片快速生長；但在煙葉成熟時期，不同處理對葉片轉(zhuǎn)化酶活性的影響不顯著。

2.1.2淀粉酶（AM）

淀粉酶是碳水化合物代謝過程中的重要酶類，可將葉綠體光合作用中積累的淀粉轉(zhuǎn)化為單糖，因而直接關(guān)系到煙葉中淀粉的積累量，進一步影響整個光合碳固定的強度，最終影響到煙葉化學(xué)成分的協(xié)調(diào)性及其香吃味。由表3可以看出，不同處理煙葉淀粉酶的活性在生長前期基本呈增強趨勢，在30葉齡時達到高峰，之后持續(xù)減弱。在30葉齡時，各處理間差異不顯著，且以T6（N2tBKI）處理最高；在煙葉成熟后期，葉片淀粉酶活性從強到弱依次為Nl>N3>N2，且在同一氮水平下K2處理葉片淀粉酶活性較高。說明低氮處理能增強葉片淀粉酶的活性，同一氮水平下中鉀處理也能增強葉片淀粉酶的活性，促進淀粉向糖的轉(zhuǎn)化，使煙葉碳代謝增強。在葉片成熟期，各處理中以T2（NIP2K2）水平下葉片淀粉酶活性最高。

2.1.3谷氨酰胺合成酶（GS）

GS是氮素同化的關(guān)鍵酶，作物吸收氮素岳在Gs的作用下合成谷氨酰胺，GS活性可以反映氮素的同化能力，與煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)密切相關(guān)。從表4可以看出，在煙葉發(fā)育過程中，不同處理的GS活性的變化規(guī)律表現(xiàn)不一致。GS活性高峰出現(xiàn)在20葉齡時，以T4（N2PIK2）處理活性較高，T1處理次之，其他處理都維持在較低的水平；在煙葉成熟期，Gs活性較低，這可能與煙株氮素重新分配有關(guān)，各處理葉片Gs的活性在中氮、低氮水平下從強到弱依次為N2>N1>N3。說明適宜的氮水平能促進煙抹的氮代謝，有利于氮代謝向碳代謝轉(zhuǎn)化。

2.1.4谷氨酸脫氫酶（GDH）谷氨酸脫氫酶是植物氮素代謝過程中的一個關(guān)鍵酶，能催化谷氨酸的合成和分解代謝。GDH是一種適應(yīng)性酶，其作用主要由細胞內(nèi)對谷氨酸和碳骨架的需求所決定。當(dāng)碳代謝受阻時，GDH的活性會增強。從表5可以看出，在中部葉生長發(fā)育過程中，不同施肥處理GDH活性總體呈現(xiàn)出先增強岳將弱的趨勢，各處理的GDH活性均在50葉齡時達到最高，且各處理之間差異不顯著，說明不同氮用量和氮磷鉀配比對GDH活性影響不大。在60葉齡后出現(xiàn)減弱的趨勢。說明隨著葉片的生長，GDH活性逐漸增強，發(fā)育后期隨著植株的衰老光合能力下降，氮素在體內(nèi)積累。

2.2不同處理對曬制后中部葉化學(xué)成分的影響

從表6可知，隨氮用量的增加，總氮和煙堿含量增加。低氮水平下，隨磷、鉀用量的增加，總糖含量提高，總氮和煙堿含量顯著下降。中氮水平下，中磷、高鉀水平（即T5）處理煙葉的煙堿含量顯著最低，且總糖含量也最低，這可能與調(diào)制期間糖消耗多有關(guān)。高氮水平下，隨磷用量的增加，總氮、煙堿含量提高，總糖含量也有不同程度的增加，說明氮用量和磷用量對曬紅煙碳水化合物和含氮化合物的含量影響較大。在中氮水平下，隨著鉀用量的增加，K2O含量呈增加趨勢。各處理中以中氮、中磷、高鉀（即T5）處理的煙葉鉀含量顯著高于其他處理，說明氮、磷水平過高會影響煙葉中鉀的積累。隨著氮用量的增加，煙葉氯含量增加，且在同一氮水平下均以低磷處理最低，說明低氮低磷處理可降低煙葉中的氯含量。

3.結(jié)論與討論

本試驗結(jié)果表明，隨著葉片的生長和成熟，INV活性均表現(xiàn)出先增強后減弱的趨勢，這與趙憲鳳等的研究結(jié)論一致。增施氮肥并不能增強代謝旺盛時期轉(zhuǎn)化酶的活性，但可以促使其代謝高峰期前移。N：P2O5在1：0.5～1.0范圍內(nèi)增施磷肥能增強NV的活性，使碳代謝能力增強，有利于糖類物質(zhì)的外運，加強體內(nèi)代謝，促進葉片快速生長。在煙葉成熟時期，增施氮肥調(diào)整氮磷鉀配比對煙葉成熟期INV活性的影響不顯著。在整個生育期，不同處理的AM活性呈“減弱增強減弱”的趨勢，在30葉齡時代謝比較旺盛。在代謝旺盛的時期，增施氮肥調(diào)整氮磷鉀配比對AM活性影響不顯著。在葉片成熟時，低氮或中鉀處理均能增強葉片AM活性，促進淀粉向糖轉(zhuǎn)化，煙葉碳代謝增強。在本試驗處理下，葉片AM活性在煙株發(fā)育前期較強，之后減弱，在煙葉成熟期活性較弱。這可能是因為前期土壤中氮素含量高，刺激了煙株的氮代謝，隨著土壤中可利用氮素含量的降低，煙株中GS活性也隨之減弱，至60葉齡時GS活性又增強，標志著煙抹氮素重新分配。在一定范圍內(nèi)隨著氮用量的增加，GS活性增強，但氮用量過高會抑制GS活性，不利于氮代謝向碳代謝轉(zhuǎn)化。在整個生育期，GDH活性與GS活性存在相互映襯的關(guān)系。GS活性在50葉齡時較弱，而GDH在50葉齡時最高，這是因為GDH作為Gs在不利情況下活性減弱的一種補償，這也是Ireland等研究的關(guān)于當(dāng)碳代謝受阻時，GDH活性會增強的一個例證。本研究結(jié)果表明，增施氮肥調(diào)整氮磷鉀配比對GDH活性較強時期的GDH活性影響不明顯。在煙葉成熟期，在煙葉成熟期，在高氮水平下GDH活性較高，且在同一氮水平下以K：處理其活性最強。煙株碳氮代謝的相互作用是影響調(diào)制后煙葉質(zhì)量和化學(xué)成分的根本因素，從以上分析可以看出，降低氮用量、增加施磷比例可以提高曬后煙葉糖含量；降低氮用量可降低煙葉煙堿、總氮的含量；在中氮水平下，增加鉀用量可提高煙葉中K20含量；低氮低磷處理可降低煙葉中氯的含量。本試驗結(jié)果表明，在中氮中磷高鉀（即T5）處理下煙葉化學(xué)成分較協(xié)調(diào)。