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    根霉纖溶酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

    2016-11-08 08:14:07李長偉邵昕昕
    科學(xué)中國人 2016年29期
    關(guān)鍵詞:等電點(diǎn)纖溶酶糖蛋白

    李長偉,邵昕昕

    牡丹江友搏藥業(yè)有限責(zé)任公司

    根霉纖溶酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

    李長偉,邵昕昕

    牡丹江友搏藥業(yè)有限責(zé)任公司

    目的:對(duì)根霉cw-1液體發(fā)酵生產(chǎn)的纖溶酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)初探,為天然溶栓藥物的開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。方法和結(jié)果:由SDS-PAGE測(cè)定該根霉纖溶酶為單一組分,相對(duì)分子量為32.5kDa;IEF電泳測(cè)定其等電點(diǎn)為8.3;該纖溶酶是一種糖蛋白,總含糖量為2.2%(w/v)。該纖溶酶可依次降解人血纖維蛋白的α、β和γ鏈。最適作用溫度和pH分別為40oC和7.5;在pH5.8~10范圍內(nèi),37℃保溫24h,殘余纖溶酶酶活在80%以上。結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)研究的根霉纖溶酶可有效降解人血纖維蛋白,并且在人的正常體溫下具有良好穩(wěn)定性,顯示了良好的溶栓藥物特性。

    根霉;纖溶酶;酶學(xué)性質(zhì);溶栓

    血栓性疾病是嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一,利用溶栓劑治療血栓病的溶栓療法被認(rèn)為是最為有效的方法之一。微生物纖溶酶作為天然來源的溶栓藥物,具有重要的臨床應(yīng)用前景及價(jià)值[1]。本文報(bào)道一種來源于根霉cw-1液體發(fā)酵的纖溶酶,對(duì)該纖溶酶的基本酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究,為進(jìn)一步溶栓藥物的開發(fā)奠定研究基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1儀器、材料與試劑

    HASUC恒溫?fù)u床;根霉纖溶酶純酶由根霉cw-1菌株分離純化制得;血纖維蛋白原、尿激酶、凝血酶購自上海經(jīng)科化學(xué)試劑有限公司,其余化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

    1.2纖溶酶活性測(cè)定

    采用血纖維蛋白平板法測(cè)定纖溶酶活力[2]。

    1.3根霉纖溶酶相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定

    應(yīng)用SDS-PAGE法測(cè)定脈孢霉纖溶酶相對(duì)分子質(zhì)量。選擇凝膠濃度為12%(w/v)的分離膠,5%(w/v)的濃縮膠,交聯(lián)度為2.6%,進(jìn)行垂直電泳。

    1.4根霉纖溶酶等電點(diǎn)測(cè)定

    應(yīng)用等電聚焦電泳(IEF)測(cè)定根霉纖溶酶的等電點(diǎn)。凝膠濃度T=7.5%,交聯(lián)度C=3%,40%載體兩性電解質(zhì),進(jìn)行水平電泳。

    1.5糖蛋白定性及定量實(shí)驗(yàn)

    應(yīng)用莫氏(Molish)試驗(yàn)對(duì)根霉纖溶酶進(jìn)行糖蛋白定性實(shí)驗(yàn);采用蒽酮比色法對(duì)含糖量進(jìn)行定量測(cè)定。

    1.6根霉纖溶酶降解人血纖維蛋白實(shí)驗(yàn)

    將2%人血纖維蛋白(溶于pH7.5的50mMTris-HCL緩沖液)200μL與60μL 0.01mg/mL的酶液混勻置于離心管中于37oC分別保溫5min、30min、1h、2h、4h和6h,以人血纖維蛋白作對(duì)照,進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。

    1.7溫度及pH對(duì)根霉纖溶酶活性的影響

    取一定量纖溶酶純酶分別置于不同溫度及pH條件下(圖1所示),測(cè)定相對(duì)酶活,以最高酶活為100%;分別將纖溶酶純酶置于不同溫度及pH條件下,分別放置2h、4h、12h和24h后測(cè)定殘余酶活,以初始酶活為100%。

    圖1 根霉纖溶酶最適作用溫度(a)及pH(b)

    2 結(jié)果

    2.1根霉纖溶酶的分子量及等電點(diǎn)

    SDS-PAGE測(cè)定該纖溶酶的相對(duì)分子質(zhì)量約為32.5kDa;IEF測(cè)定其等電點(diǎn)為8.3。

    2.2根霉纖溶酶糖蛋白測(cè)定結(jié)果

    莫氏實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該纖溶酶液面交界處有紫色環(huán)出現(xiàn),說明該酶蛋白中有可能有糖存在;進(jìn)一步應(yīng)用蒽酮比色法確定了該蛋白含糖量為2.2%(w/v)。

    2.3根霉纖溶酶降解人血纖維蛋白情況

    本實(shí)驗(yàn)用SDS-PAGE檢測(cè)該纖溶酶對(duì)人血纖維蛋白的降解規(guī)律,結(jié)果顯示,作用5min后α鏈已經(jīng)完全降解,1h后β鏈完全降解,2h后γ鏈降解完畢,這一降解順序與人纖溶酶降解纖維蛋白各亞基的情況是一致的。

    2.4根霉纖溶酶的最適溫度、pH及其穩(wěn)定性

    實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在pH7.5條件下,該纖溶酶的最適作用溫度為40oC;在40oC下測(cè)定該酶的最適pH為7.5(圖1所示)。同時(shí),在pH5.8~10范圍內(nèi),37oC保溫24h,該纖溶酶殘余酶活在80%以上。

    3 討論

    本實(shí)驗(yàn)對(duì)根霉cw-1纖溶酶的純酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究,該酶的最適作用溫度及pH接近人體環(huán)境,并且在人體正常環(huán)境下測(cè)定該酶的穩(wěn)定性良好。另外,該酶對(duì)人血纖維蛋白三個(gè)亞基的降解順序與人纖溶酶一致,可見該根霉纖溶酶在性質(zhì)上具有開發(fā)成溶栓藥物的潛力。

    [1]張?chǎng)┦?,劉曉蘭,鄭喜群,等.蛹蟲草無性型深層培養(yǎng)液中纖溶酶的分離純化和酶學(xué)性質(zhì)研究[J].微生物學(xué)通報(bào),2012(12)∶1787-1795.

    [2]ASTRUP T,MULLERTZ S.The fibrin plate methed for estimating fibrinolytic activity[J].Arch Biochem Biophys,1952(40)∶346-351.

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