提取肺癌小活檢標(biāo)本固定液中的DNA進(jìn)行EGFR突變檢測(cè)的可行性分析

廖炫之 顧瑩瑩 姜桔紅

肺癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率及死亡率居我國(guó)首位[1]。大多數(shù)患者就診時(shí)已處于晚期，因此臨床上以多學(xué)科綜合治療為主。其中靶向治療由于具有高選擇性、低毒性和耐受性良好的優(yōu)勢(shì)，成為治療肺癌特別是非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）的重要手段之一。NSCLC的靶向藥物很多，分別針對(duì)不同的靶點(diǎn)，有表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）突變、動(dòng)物微管相關(guān)蛋白4與間變性淋巴瘤激酶融合基因（echinoderm microtubule associated protein like 4-anaplastic lymphoma kinase,EML4-ALK）、間充質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化因子受體（cellular-mesenchymal to epithelial transition factor,C-MET）擴(kuò)增、鼠類肉瘤病毒癌基因同源物B1（v-raf murine sar-coma viral oncogene homolog B1,BRAF）突變及C-ros原癌基因1-受體酪氨酸激酶（C-rosoncogene 1-receptor tyrosine kinase,ROS1）重排等，其中表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKIs）應(yīng)用最為廣泛。研究表明EGFR-TKIs反應(yīng)敏感突變主要是19號(hào)外顯子缺失突變、21號(hào)外顯子L858R突變及20號(hào)外顯子插入等，而耐藥突變有20號(hào)外顯子T790M、19號(hào)外顯子L747S及20號(hào)外顯子D761Y等[2-6]。臨床上可用于EGFR突變檢測(cè)標(biāo)本有組織標(biāo)本、細(xì)胞學(xué)標(biāo)本、血液標(biāo)本等，其中組織標(biāo)本是基因檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，然而部分病例活檢組織中的腫瘤細(xì)胞量較少，進(jìn)行診斷性的免疫組化之后組織不夠進(jìn)行分子檢測(cè)。本研究中，我們擬探討提取取材后殘留的標(biāo)本固定液中的DNA進(jìn)行EGFR檢測(cè)的可行性。分析這一方法的敏感性及特異性。

1 資料與方法

1.1 病例資料及樣本的收集 收集2018年3月-2018年8月廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸病理中心28例經(jīng)臨床ARMS法檢測(cè)為EGFR突變陽(yáng)性及20例突變陰性取材后的小活檢標(biāo)本固定液，另外收集52例EGFR突變未知的肺癌患者小活檢石蠟包埋組織及其配對(duì)的取材后標(biāo)本固定液同時(shí)進(jìn)行EGFR檢測(cè)。收集患者的臨床病理資料，包括：性別、年齡、吸煙史、取材方式及HE切片腫瘤細(xì)胞比例等資料。入組標(biāo)準(zhǔn)：病理資料完整；無(wú)其他惡性腫瘤；取材均符合規(guī)范。

1.2 細(xì)胞固定液的收集 將取材后剩下的15 mL標(biāo)本固定液倒入50 mL的離心管中，為了沉淀標(biāo)本固定液中可能存在的游離DNA，同時(shí)加入11 mL異丙醇及650 μL的 5 mol/L NaCl后，混勻，4,000 rpm 4 ℃離心30 min，棄上清液。為了洗滌標(biāo)本殘留的福爾馬林，加入600 μL PBS，混勻，將其轉(zhuǎn)移至1.5 mL的EP管中，再加入440 μL異丙醇，混勻，13,000 rpm 4 ℃離心30 min，棄上清，獲得的細(xì)胞沉渣及DNA沉淀保存于-80 ℃冰箱。

1.3 DNA提取 石蠟包埋組織切片及配對(duì)的取材后標(biāo)本固定液細(xì)胞沉渣及DNA沉淀均用QIAGEN DNA提取試劑盒（DNeasy Blood and Tissue Kit）提取，具體步驟如下：每份樣本中加入180 μL Buffer ATL。加入20 μL蛋白激酶K，振蕩混勻，56 ℃孵育至組織完全裂解，孵育過(guò)程中間斷振蕩。加入200 μL Buffer AL，振蕩混勻，血標(biāo)本需在56 ℃下孵育10 min。加入200 μL乙醇，振蕩混勻。將上述混合物用移液槍移至2 mL離心管中的DNeasy Mini濾柱中，6,000g（8,000 rpm）離心1 min，棄去濾出液及離心管。將濾柱放入新的2 mL收集管中，加入500 μL Buffer AW1，≥6,000g離心1 min，棄去濾出液及收集管。將濾柱移至新的1.5 mL或2 mL離心管。將200 μL Buffer AE加至濾柱膜中央以洗提DNA，室溫（15 ℃-25 ℃）下孵育1 min。≥6,000 ℃冰箱中。

1.4EGFR基因突變檢測(cè) 用ARMS法檢測(cè)提取DNA的EGFR基因突變狀態(tài)，包括18號(hào)-21號(hào)外顯子共29個(gè)突變熱點(diǎn)。每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)突變陰性、陽(yáng)性對(duì)照及空白對(duì)照孔，反應(yīng)參數(shù)依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)設(shè)定。根據(jù)說(shuō)明書(shū)判定標(biāo)準(zhǔn)對(duì)PCR反應(yīng)擴(kuò)增曲線及CT值進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析和處理，計(jì)數(shù)資料采用卡方或Fisher確切概率法分析。P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 患者臨床特征 總共100例患者，年齡＜60歲占51.0%（51/100），≥60歲占49.0%（49/100），男性占56.0%（56/100），女性占44.0%（44/100），有吸煙史占40.0%（40/100），無(wú)吸煙史占60.0%（60/100），經(jīng)電子支氣管鏡取材的占44.0%（44/100），經(jīng)皮肺穿刺的占15.0%（15/100），超聲內(nèi)鏡引導(dǎo)下的經(jīng)支氣管針吸活檢（endobronchailultrasound guided-transbronchial needle aspiration, EBUS-TBNA）取材占41.0%（41/100）。HE切片腫瘤細(xì)胞比例＜50%的占68.0%（68/100），HE切片腫瘤細(xì)胞比例≥50%的占32.0%（32/100）。見(jiàn)表1。

2.2 比較經(jīng)臨床ARMS法檢測(cè)為EGFR突變陽(yáng)性及陰性所配對(duì)的小活檢標(biāo)本固定液EGFR突變狀態(tài) 為了驗(yàn)證取材后的小活檢標(biāo)本固定液能夠用于基因檢測(cè)，挑選了28例石蠟包埋組織標(biāo)本經(jīng)臨床ARMS法檢測(cè)為EGFR突變陽(yáng)性的病例，用所配對(duì)的取材后標(biāo)本固定液提取的DNA檢測(cè)出20例EGFR突變陽(yáng)性。28例石蠟包埋組織標(biāo)本檢測(cè)12例19外顯子缺失突變、6例21號(hào)外顯子L858R突變及2例18號(hào)外顯子G719X突變，用所配對(duì)的固定液全部檢測(cè)出來(lái)，但是另外6例20號(hào)外顯子插入突變及2例19外顯子缺失用所配對(duì)標(biāo)本固定液未能檢出。見(jiàn)圖1及表2。20例石蠟包埋組織標(biāo)本經(jīng)臨床ARMS法檢測(cè)EGFR突變陰性病例用所配對(duì)的固定液檢測(cè)全部為陰性。其靈敏度為71.4%（20/28），特異性為100.0%（20/20），兩者一致率為83.3%（40/48），見(jiàn)表3。

2.3 比較52例肺癌小活檢石蠟包埋組織及配對(duì)的標(biāo)本固定液EGFR突變狀態(tài) 為了進(jìn)一步驗(yàn)證取材后小活檢標(biāo)本固定液檢測(cè)EGFR突變的靈敏度及特異性，隨機(jī)收集52例EGFR突變未知肺癌患者小活檢石蠟包埋組織和配對(duì)的標(biāo)本固定液標(biāo)本，EGFR突變陽(yáng)性率分別為36.5%（19/52）和28.8%（15/52），標(biāo)本固定液DNA檢測(cè)的靈敏度及特異性分別為78.9%（15/19）和100.0%（33/33），兩者一致率為92.3%（48/52），見(jiàn)表4。其中石蠟包埋組織共檢測(cè)出19例EGFR突變，其中7例19外顯子缺失突變、6例21號(hào)外顯子L858R突變及2例20號(hào)外顯子插入突變用所配對(duì)的取材后小活檢標(biāo)本固定液也能檢測(cè)出來(lái)；3例19外顯子缺失、1例21號(hào)外顯子L858R突變用所配對(duì)的取材后小活檢標(biāo)本固定液并未檢出，見(jiàn)表5。

2.4 100例取材后小活檢標(biāo)本固定液中的DNA濃度 100例取材后的小活檢標(biāo)本固定液標(biāo)本提取的DNA后，測(cè)量DNA濃度＞10 ng/μL有70例，5 ng/μL-10 ng/μL有18例，＜5 ng/μL有12例。石蠟包埋組織EGFR檢測(cè)結(jié)果與所配對(duì)的標(biāo)本固定液檢測(cè)結(jié)果相一致的88例病例中，其標(biāo)本固定液DNA濃度＞10 ng/μL有68例，5 ng/μL-10 ng/μL有16例，＜5 ng/μL有4例。EGFR檢測(cè)不一致的12例病例中，其對(duì)應(yīng)的標(biāo)本固定液DNA濃度＞10 ng/μL有8例，5 ng/μL-10 ng/μL有2例，＜5 ng/μL有2例。EGFR突變檢測(cè)是否一致與DNA濃度有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，DNA濃度高，EGFR突變檢測(cè)結(jié)果一致較高，見(jiàn)表6。HE切片腫瘤細(xì)胞比例與標(biāo)本固定液提取的DNA濃度有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，HE切片中腫瘤細(xì)胞比例相對(duì)較高的病例，其標(biāo)本固定液提取的DNA濃度越高，見(jiàn)表7。

2.5 100例肺癌患者小活檢石蠟包埋組織及配對(duì)的標(biāo)本固定液EGFR與臨床特征之間的關(guān)系 100例肺癌患者小活檢石蠟包埋組織及配對(duì)的標(biāo)本固定液，結(jié)果兩者EGFR突變與年齡、性別及吸煙史有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），在年齡＜60歲、無(wú)吸煙史、女性肺癌患者中EGFR突變率更高，而與取材方式及HE切片腫瘤細(xì)胞比例無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表8。

3 討論

近年來(lái)，隨著腫瘤驅(qū)動(dòng)基因與臨床病理關(guān)系的日趨明晰，尤其分子靶向治療的發(fā)展，使得肺癌的治療模式發(fā)生了很大變化。分子靶向治療由于具有高選擇性、低毒性和耐受性良好的優(yōu)勢(shì)，成為治療肺癌特別是NSCLC的重要手段之一。NSCLC治療的靶向藥物很多，有EGFR抑制劑、ALK抑制劑、BRAF抑制劑、ROS1抑制劑等，分別針對(duì)不同的靶點(diǎn)。各個(gè)靶點(diǎn)在NSCLC中發(fā)生的突變頻率各不相同，其中EGFR突變率最高，約為24.5%-36.2%[7,8]，EML4-ALK融合基因約為3.3%-4.9%[8,9]，BRAF突變約為3%-4%[7,10]，ROS1重排約為1%-2%[11,12]。

靶向治療之前需要進(jìn)行基因檢測(cè)。基因檢測(cè)的標(biāo)本有三類：細(xì)胞學(xué)標(biāo)本、血液標(biāo)本及組織標(biāo)本。它們各自都有優(yōu)缺點(diǎn)。細(xì)胞學(xué)標(biāo)本優(yōu)點(diǎn)是創(chuàng)傷較少，缺點(diǎn)是并不是所有患者都有胸腹水，另外細(xì)胞學(xué)標(biāo)本易受標(biāo)本內(nèi)非腫瘤細(xì)胞的干擾，而且其獲取的DNA量極少，極易出現(xiàn)假陰性的情況。血液標(biāo)本優(yōu)點(diǎn)是獲取容易、無(wú)創(chuàng)，能夠克服腫瘤的異質(zhì)性，可以反映整個(gè)腫瘤的突變變化；缺點(diǎn)就是血液中的循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）含量極少，ctDNA因檢測(cè)方法的不同其靈敏度差異較大，這都限制了外周血在腫瘤分子檢測(cè)方面的應(yīng)用[13-15]。組織標(biāo)本所含的腫瘤細(xì)胞多，特異性及靈敏度高，是基因檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。但是，部分病例小活檢取的組織較少，而且病理診斷過(guò)程中免疫組化需要切除部分組織，另外靶向治療需要檢測(cè)的靶點(diǎn)多，導(dǎo)致部分病例的組織不夠進(jìn)行某些靶點(diǎn)分子檢測(cè)。為了增加病人靶向治療之前的分子檢測(cè)標(biāo)本來(lái)源，我們首次提出利用取材后殘留的標(biāo)本固定液中的DNA進(jìn)行EGFR檢測(cè)，探討其可行性。

表1 100例肺癌患者臨床資料Tab 1 Clinical characteristics of 100 patients with lung cancer

表2 經(jīng)臨床ARMS法檢測(cè)石蠟包埋組織為EGFR突變陽(yáng)性配對(duì)的小活檢標(biāo)本固定液EGFR突變類型Tab 2 EGFR mutation status of fixation liquid of lung cancer biopsy in EGFR mutation positive by clinical ARMS in paraffin-embedded tissue

表3 比較經(jīng)臨床ARMS法檢測(cè)石蠟包埋組織為EGFR突變陽(yáng)性及陰性所配對(duì)的小活檢標(biāo)本固定液EGFR突變狀態(tài)Tab 3 Comparison of EGFR mutation status of fixation liquid of lung cancer biopsy in EGFR mutation positive and negative by clinical ARMS in paraffin-embedded tissue

表4 比較52例肺癌小活檢石蠟包埋組織及配對(duì)的標(biāo)本固定液EGFR突變狀態(tài)Tab 4 Comparison of EGFR mutation status in paraffin-embedded tissue and matched fixation liquid of 52 lung cancer biopsy

表5 52例肺癌小活檢石蠟包埋組織及配對(duì)的標(biāo)本固定液EGFR突變類型Tab 5 The mutation type of EGFR in paraffin-embedded tissue and matched fixation liquid of 52 lung cancer biopsy

表6 取材后小活檢標(biāo)本固定液中提取的DNA濃度與EGFR檢測(cè)結(jié)果的關(guān)系Tab 6 The correlation between EGFR results and the concentration of DNA extracted from fixation liquid of lung cancer biopsy

表7 肺癌患者小活檢HE切片腫瘤細(xì)胞比例與標(biāo)本固定液中提取的DNA濃度的相關(guān)性Tab 7 The correlation between tumor cells proportion of HE stain and the concentration of DNA extracted from fixation liquid of lung cancer biopsy

表8 100例肺癌患者小活檢石蠟包埋組織及配對(duì)的標(biāo)本固定液EGFR基因突變與臨床特征之間的關(guān)系Tab 8 The correlation between EGFR mutation status and clinical features of 100 paraffin-embedded tissue and matched fixation liquid of lung cancer biopsy

取材后殘留的標(biāo)本固定液存在微小的組織、懸浮細(xì)胞及游離的DNA，其中微小組織及懸浮細(xì)胞可以通過(guò)離心獲取，但是游離的DNA單靠離心是無(wú)法沉淀的，為此我們?cè)陔x心之前加了異丙醇及高濃度的NaCl溶液沉降游離的DNA。100例標(biāo)本中提取的DNA濃度＞10 ng/μL有70例，5 ng/μL-10 ng/μL有18例，＜5 ng/μL有12例。

圖1 ARMS法檢測(cè)EGFR突變代表性圖：EGFR突變型（A）與EGFR野生型（B）Fig 1 Representative pictures of EGFR mutation detected by ARMS: EGFR mutation (A) and EGFR wild type (B)

在本研究中，所有的患者均采用了ARMS法進(jìn)行EGFR突變檢測(cè)。ARMS法對(duì)腫瘤DNA含量的要求較低，甚至只需1%即可，方法簡(jiǎn)單易行，特異性及敏感性都較高，因而廣泛使用[16]。本研究先檢測(cè)了28例經(jīng)臨床檢測(cè)為EGFR突變陽(yáng)性病例所對(duì)應(yīng)的標(biāo)本固定液中的DNA，其中檢測(cè)出EGFR突變陽(yáng)性20例；然后檢測(cè)20例經(jīng)臨床檢測(cè)為EGFR突變陰性病例所對(duì)應(yīng)的標(biāo)本固定液中的DNA，結(jié)果均為陰性，其靈敏度及特異性分別為71.4%和100.0%，一致率為83.3%。為了排除事先知道EGFR突變狀態(tài)所引起的選擇性偏倚，我們后來(lái)隨機(jī)選取52例EGFR突變未知的肺癌患者石蠟包埋組織及配對(duì)的標(biāo)本固定液標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果石蠟包埋組織檢出突變型19例（19/52），標(biāo)本固定液中檢出突變型15例（15/52），標(biāo)本固定液檢測(cè)的靈敏度及特異性分別為78.9%和100.0%，兩者一致率為92.3%。前者靈敏度略微低于后者靈敏度，而特異性都為100.0%，表明利用取材后的小活檢標(biāo)本固定液進(jìn)行EGFR檢測(cè)是一種可行的途徑。

我們?cè)谶@100例肺癌患者中，總共發(fā)現(xiàn)12例患者配對(duì)的樣本結(jié)果不一致，其中石蠟包埋組織EGFR檢測(cè)為陽(yáng)性突變，但是所配對(duì)的標(biāo)本固定液檢測(cè)結(jié)果全為陰性。分析其標(biāo)本固定液中的DNA濃度，其中8例（66.7%）DNA濃度低于5 ng/μL，2例（16.7%）DNA在5 ng/μL-10 ng/μL，而在EGFR檢測(cè)結(jié)果相一致的88例標(biāo)本固定液中，68例（77.3%）DNA濃度大于10 ng/μL，只有4例（4.5%）DNA濃度小于5 ng/μL，由此可見(jiàn)，標(biāo)本固定液中的DNA含量過(guò)少是造成組織樣本檢測(cè)不一致的主要原因。但是配對(duì)樣本結(jié)果不一致中仍有2例（16.7%）DNA濃度高于10 ng/μL，可見(jiàn)除了標(biāo)本固定液中的DNA含量過(guò)少是組織樣本檢測(cè)不一致的原因外，其中腫瘤細(xì)胞DNA含量低于ARMS法檢測(cè)的閾值或許也是其原因之一[17]。為了探明小活檢標(biāo)本固定液未檢出的EGFR突變是DNA濃度過(guò)低導(dǎo)致的，還是其他原因引起的，條件許可時(shí)可進(jìn)行更敏感的微滴度PCR方法或二代測(cè)序方法。另外我們分析了HE切片腫瘤細(xì)胞比例與標(biāo)本固定液提取的DNA濃度之間是否存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HE切片中腫瘤細(xì)胞比例相對(duì)較高的病例，其標(biāo)本固定液提取的DNA濃度越高。

總而言之，提取肺癌小活檢標(biāo)本固定液中的DNA進(jìn)行EGFR突變檢測(cè)可能是一種可行的EGFR突變檢測(cè)標(biāo)本來(lái)源。我們將進(jìn)一步驗(yàn)證此標(biāo)本來(lái)源進(jìn)行其他靶向治療基因檢測(cè)的可行性。