肺癌組織中DNA聚合酶β基因突變的研究

吳青峻 田文鑫 于瀚博 黃川 焦鵬 馬超 王永忠 黃文 孫耀光 艾斌 佟宏峰

作為遺傳信息的載體，基因組DNA很容易受到化學(xué)（如烷化劑）、物理（如紫外線）和生物作用（如活性氧）的損傷，這也是癌癥成為現(xiàn)代社會(huì)人類生命首要威脅的原因之一。據(jù)報(bào)道，僅活性氧就可造成真核生物每個(gè)細(xì)胞、每天產(chǎn)生至少10,000個(gè)DNA損傷位點(diǎn)[1]。堿基切除修復(fù)（base excision repair, BER）是細(xì)胞應(yīng)對(duì)DNA損傷并自行修復(fù)的重要途徑之一，DNA聚合酶β是參與BER過程最主要的DNA聚合酶，具有DNA聚合和dRP裂解酶雙重活性[2]。國(guó)外已有研究[3]表明，約30%的常見腫瘤中存在DNA聚合酶β突變體，但受到所用標(biāo)本量的限制（7種腫瘤僅149例病例），其結(jié)論是否準(zhǔn)確尚待進(jìn)一步證實(shí)。例如早期在結(jié)直腸癌中的研究?jī)H有6例標(biāo)本入組，有5例攜帶突變，突變率高達(dá)83%[4]，但隨后較大樣本的篩查表明，僅40%的腫瘤組織發(fā)現(xiàn)存在DNA聚合酶β突變體[5]。Bhattacharyya等[6]最早檢測(cè)了肺癌腫瘤組織中DNA聚合酶β的突變情況，通過對(duì)11例肺癌患者癌組織和癌旁組織的RT-PCR檢測(cè)，共發(fā)現(xiàn)了3種不同的變異體類型，但這些變異類型并不是腫瘤特異性表達(dá)的突變類型。目前還尚未見中國(guó)人群肺癌組織中DNA聚合酶β的突變情況的文獻(xiàn)報(bào)道。本研究通過對(duì)69例肺癌患者腫瘤及癌旁組織開展DNA聚合酶β編碼基因Polb的全外顯子測(cè)序分析，系統(tǒng)研究了我國(guó)漢族肺癌患者中DNA聚合酶β的遺傳突變規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 樣本基本信息 收集2018年2月-2018年9月北京醫(yī)院住院收治的69例漢族肺癌患者的新鮮組織，術(shù)中取腫瘤組織及距腫瘤組織2 cm-3 cm處的癌旁組織，樣本離體后5 min內(nèi)分裝至2 mL凍存管并迅速放至液氮中速凍，并置-80 ℃長(zhǎng)期儲(chǔ)存?zhèn)溆?。入組樣品均在術(shù)后均得到明確的病理學(xué)證實(shí)。所有納入實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象均已簽署知情同意書。患者中位年齡65.26歲（49歲-84歲），其中男性35例、女性34例，具體臨床信息詳見表1。

1.2 基因組DNA提取及基因擴(kuò)增 取適量癌及癌旁組織液氮下研磨成粉末，采用鹽析法[7]提取基因組DNA。配制30 μL PCR反應(yīng)混合物：含15 μL 2×Taq Plus Master Mix II（南京諾唯贊生物技術(shù)公司），0.2 μmol/L擴(kuò)增引物及50 ng提取的DNA。利用表2中列出的引物及擴(kuò)增條件進(jìn)行如下擴(kuò)增反應(yīng)：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性15 s，60 ℃-63 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s-3 min 45 s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分離后，使用凝膠回收試劑盒（北京博邁德生物技術(shù)有限公司）回收目的條帶，并送北京天一輝遠(yuǎn)生物技術(shù)有限公司，以表3中列出的引物進(jìn)行DNA Sanger測(cè)序。

1.3 基因測(cè)序結(jié)果分析 NCBI數(shù)據(jù)庫中下載野生型人Polb基因的DNA序列為標(biāo)準(zhǔn)序列（NC_000008.11），使用Lasergene軟件（版本號(hào)7.1）中的Seqman組件對(duì)獲得的測(cè)序峰圖文件進(jìn)行比對(duì)拼接，雜合子檢測(cè)閾值設(shè)置為＞15%，并人工對(duì)軟件檢測(cè)出的候選雜合子利用Chromas軟件（版本號(hào)2.22）進(jìn)行逐個(gè)鑒定，以排除測(cè)序噪音對(duì)研究結(jié)果的干擾。為保證研究結(jié)果的可信性，利用與原測(cè)序引物相反方向的PCR擴(kuò)增引物進(jìn)行反向測(cè)序以二次驗(yàn)證其真?zhèn)巍?/p>

2 結(jié)果

2.1Polb基因的PCR擴(kuò)增 利用表2中列出的引物及擴(kuò)增條件，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，本研究成功獲得了與預(yù)期條帶大小完全相符的擴(kuò)增產(chǎn)物（圖1），Sanger測(cè)序分析表明，各擴(kuò)增產(chǎn)物均來自于人Polb基因。

表1 入組患者的臨床病例特征Tab 1 Clinical and pathologic characters of enrolled patients

表2 Polb基因PCR擴(kuò)增用引物Tab 2 Primers used for amplification of human Polb gene

表3 Polb基因啟動(dòng)子區(qū)及外顯子測(cè)序引物Tab 3 Sequencing primers for promoter and exons of Polb gene

表4 肺癌患者中發(fā)現(xiàn)的Polb基因突變類型及分布頻率Tab 4 Mutations and their frequencies of Polb gene in lung cancer patients

2.2 肺癌組織中Polb基因的突變頻率分析 本研究系統(tǒng)分析了69例肺癌患者癌組織及癌旁組織中Polb基因的突變情況，經(jīng)與野生型序列的比對(duì)分析，共計(jì)發(fā)現(xiàn)5種不同的突變類型，其中3種突變（-196G＞T, -188_-187insCGCCC,-168C＞A）位于啟動(dòng)子區(qū)，2種突變（587C＞G, 612A＞T）位于編碼區(qū)，587C＞G突變可引起第196位氨基酸由蘇氨酸替換為絲氨酸，612A＞T突變?yōu)橥x突變（圖2）。各突變體的基因頻率及基因型頻率詳見表4。所有這些突變位置均可在腫瘤及對(duì)應(yīng)的癌旁組織中同時(shí)被檢測(cè)到，表明這些Polb基因的突變類型并非肺癌組織所特有。

圖1 Polb基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜Fig 1 PCR products of Polb gene in lung cancer patients.M: DL5000 marker, 1-7: PCR products corresponding to the column of regions in Tab 2.

圖2 Polb突變體的典型測(cè)序圖譜Fig 2 Typical sequencing electropherogram of Polb mutations

3 討論

DNA聚合酶是堿基切除修復(fù)中最關(guān)鍵的聚合酶，早期的遺傳篩查研究[3,8,9]表明，肺癌、胃癌、乳腺癌、腸癌、前列腺癌腫瘤組織中均可檢測(cè)到Polb基因變異體的高表達(dá)。隨著研究的深入，部分學(xué)者認(rèn)為大多數(shù)腫瘤中均存在Polb基因的突變，其中包括大片段的缺失、插入及各種形式的點(diǎn)突變，突變頻率從15%-75%不等，平均頻率為30%左右，且多數(shù)突變體均可導(dǎo)致DNA聚合酶β活性下降，進(jìn)而導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性增加及細(xì)胞癌化[3,10]。但另一部分學(xué)者[11-13]認(rèn)為，這些突變絕大多數(shù)只發(fā)生在RNA水平，是由于RNA的選擇性剪切導(dǎo)致，而非基因組DNA發(fā)生突變所致，其中外顯子2和外顯子11的缺失突變類型發(fā)生頻率最高。

圖3 3種突變體在Polb基因核心啟動(dòng)子區(qū)的位置示意圖Fig 3 Site location of three detected mutations in human Polb core promoter.The mutated sites are indicated as red bold italics and sequences matching SP1 and ATF/CREB-binding sites are boxed.The nucleotide A in start codon is designated as +1.TSP: transcription start point； TI: the 18-nt tsp region.

Bhattacharyya等[6]最早在肺癌腫瘤組織中檢測(cè)到了DNA聚合酶β，11例肺癌腫瘤組織中檢測(cè)到了3種DNA聚合酶β變異體，分別是87 bp、140 bp的缺失和105 bp的插入。這些變異體均只在cDNA中檢出，基因組DNA中未檢出，且癌旁組織和正常人的肺組織標(biāo)本也存在同樣的突變。從基因結(jié)構(gòu)分析，這些突變體應(yīng)該分別來自外顯子11的缺失、外顯子13的缺失和外顯子α的插入，是由于RNA的選擇性剪切所致，而非來源于基因組DNA的突變。本研究通過對(duì)69例漢族肺癌患者組織標(biāo)本的基因篩查，基因組DNA中未發(fā)現(xiàn)腫瘤特異性表達(dá)的Polb基因突變。與Bhattacharyya等[6]的研究類似，所有發(fā)現(xiàn)的5種突變?cè)诎┖桶┡越M織中均可被檢出，提示這些Polb基因突變并不是肺癌腫瘤組織所特有。

本研究發(fā)現(xiàn)的Polb基因突變類型有2種發(fā)生在編碼區(qū)，其中587C＞G可引起氨基酸水平上第196位由蘇氨酸T突變?yōu)榻z氨酸S，未見有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，可能是漢族人群特有的Polb基因突變類型，在本研究入組樣本中有2.9%的人群攜帶此突變。196位蘇氨酸位于DNA聚合酶β的C結(jié)構(gòu)域，是發(fā)揮DNA聚合酶活性的重要區(qū)域[14]，該突變是否會(huì)引起DNA聚合酶β功能發(fā)生改變不得而知，需要開展體外蛋白活性實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)加以研究。

本研究在Polb基因啟動(dòng)子區(qū)共檢測(cè)到3個(gè)突變位點(diǎn)，其中-188_-187insCGCCC突變類型為首次報(bào)道。如圖3所示，3種檢測(cè)到的突變體均位于Polb基因核心啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)[15]，位于或緊鄰轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的核心區(qū)段。-196G＞T和-168C＞A由鄭州大學(xué)的董子明組在食管癌組織中被首次報(bào)道[16]。體外實(shí)驗(yàn)[17]表明，兩種突變均可引起Polb基因啟動(dòng)子活性的明顯增強(qiáng)，并導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)化療藥cisplatin的抗藥性[18]。本研究在啟動(dòng)子區(qū)發(fā)現(xiàn)了一種新的插入性突變體-188_-187insCGCCC，其插入位點(diǎn)位于轉(zhuǎn)錄因子SP1的核心結(jié)合位點(diǎn)，且插入堿基多達(dá)5 nt，推測(cè)該插入突變可能會(huì)顯著降低對(duì)轉(zhuǎn)錄因子SP1的親和力，進(jìn)而降低啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)活性，并導(dǎo)致DNA聚合酶β蛋白表達(dá)量的降低。

總之，本研究通過對(duì)69例漢族肺癌患者腫瘤組織的基因篩查，共發(fā)現(xiàn)5種Polb基因的突變類型，其中有兩種突變類型為首次報(bào)道。考慮到發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)的種類和發(fā)生頻率較已有西方人群的報(bào)道明顯偏少，且這些突變點(diǎn)在癌和癌旁組織中均可被檢出，提示這些突變并不是肺癌腫瘤組織所特有，Polb基因突變可能不是中國(guó)漢族肺癌患者的腫瘤標(biāo)志物。