復(fù)方青黛膜劑的制備和質(zhì)量控制

李 真，宋 潔，張志國

復(fù)方青黛膜為中國人民解放軍第960醫(yī)院泰安院區(qū)（原解放軍第88醫(yī)院）研制，由復(fù)方青黛散（2015年版的《中國人民解放軍醫(yī)療機構(gòu)制劑規(guī)范》第53頁）進行劑型改造而制成的一種非標(biāo)準(zhǔn)制劑。但散劑易被唾液沖散，不能長時間作用于患處，經(jīng)研究可與無毒、無刺激、性質(zhì)穩(wěn)定、不影響主藥藥效且成模性能良好的羧甲基纖維素鈉成膜材料制成薄膜制劑。具有清熱解毒，鎮(zhèn)痛消腫作用，用于口腔炎、口腔潰瘍［1］，方中青黛具有清熱解毒，涼血消斑、瀉火定驚的功效［2］，其主要成分是靛藍和靛玉紅［3-5］。該制劑能準(zhǔn)確定位，起效快，大大提高了藥物的生物利用度。為完善復(fù)方青黛膜的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并進一步提高醫(yī)療機構(gòu)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，筆者對該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進行修訂，建立相應(yīng)的高效液相色譜法［6-10］來測定復(fù)方青黛膜中靛藍和靛玉紅的含量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Agilent 1200 LC型高效液相色譜儀（G1311A輸液泵、G1329A自動進樣器、G1316A柱溫箱、G1314B VWD檢測器、Chemstation色譜工作站）；電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；HS3120超聲波清洗器 （上海楚定分析儀器有限公司）。

1.2 試藥羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，安徽山河藥用輔料股份有限公司）；薄荷腦（南通薄荷廠）；冰片（濟南潤正藥材有限公司）；PEG6000（鞍山恒泰藥用輔料有限公司）；甘油（湖南爾康制藥股份有限公司）；靛藍對照品（中國食品藥品檢定研究院）；靛玉紅對照品（中國食品藥品檢定研究院）；復(fù)方青黛膜（原解放軍 88 醫(yī)院，批號 170720、170703、170626）；甲醇為色譜純；水為滅菌注射用水；其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 處方組成復(fù)方青黛散37.5 g，羧甲基纖維素鈉 62.5 g，丙二醇 31.3 g，吐溫-80 15.6 g，甘油 15.6 g，20%PEG6000 62.6 ml，水適量，制得 1000 g。

2.2 制備工藝復(fù)方青黛散9味，除冰片、薄荷腦外，牛黃、枯礬共研成細粉，加入青黛，煅石膏細粉充分研磨混合；其余3味粉碎成最細粉與上述藥粉混勻；將冰片、薄荷腦與適量上述細粉研細，再與上述藥粉按等量遞增配研法配研，過篩，混勻，制成1000 g，既得。取羧甲基纖維素鈉，加約200 ml蒸餾水，充分浸泡溶脹后，放置過夜，制成膠漿。另取復(fù)方青黛散置乳缽中，加入丙二醇，吐溫-80，研勻，加入到上述膠漿中，乳缽用適量的水沖洗，洗液并入膠漿中，再加入甘油，20%PEG6000，充分攪拌均勻，放置，待氣泡除盡后，均勻涂布于事先涂液體石蠟油的20 cm×16 cm玻璃板上，置于干燥箱60℃烘干，脫膜，分裝，即得。

3 質(zhì)量評價

該品性狀為墨綠色薄膜，有冰片、薄荷腦的特臭。

口腔黏附時間的考察：選6名健康志愿者，將1 cm×1 cm的藥膜黏附于受試者口腔上顎，試驗期間禁水，記錄藥膜在口腔中的黏附時間。結(jié)果藥膜與口腔上顎黏附緊密，平均滯留時間為28 min。

重量差異檢查：按中國藥典（2015年版）二部附錄膜劑項下的有關(guān)規(guī)定進行，平均片重0.58 g，

4 靛藍的含量測定

4.1 溶液的制備

4.1.1 對照品溶液的制備 精密稱定靛藍對照品5.3 mg，加三氯甲烷超聲處理 1 min（250 W，33 kHz），制得每1 ml含靛藍5.3μg的溶液，即得。

4.1.2 供試品溶液的制備 取該品0.25 g，加三氯甲烷適量超聲處理 1 h（250 W，33 kHz），濾過，將三氯甲烷液轉(zhuǎn)移到50 ml容量瓶中稀釋至刻度，作為供試品溶液。

4.1.3 陰性對照品溶液的制備 根據(jù)樣品處方比例稱取除青黛以外的藥材，制成缺青黛的陰性制劑，再按“4.1.2”項下方法處理，即得陰性對照品溶液。

4.2 色譜條件色譜柱：Diamonsil C18（2）柱（250mm×4.6 mm，5 μm）；以甲醇-水（60∶40）為流動相；檢測波長為285 nm；柱溫為25℃；流速1.0 ml/min；進樣量為20μl；理論板數(shù)靛藍峰計算不低于1500。

4.3 系統(tǒng)適用性試驗分別精密吸取20μl“4.1.1、4.1.2和4.1.3”項下制備的對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液，分別按“4.2”項下色譜條件進行測定，色譜圖見圖1。

圖1 靛藍HPLC圖

4.4 線性關(guān)系考察取“4.1.1”項下靛藍對照品貯備液適量，以三氯甲烷為溶劑稀釋，得系列標(biāo)準(zhǔn)溶液， 含靛藍 0.53、1.06、2.12、4.24、5.30、6.36 μg/ml，分別精密吸取20μl，按“4.2”項下色譜條件進行測定。 以峰面積值為縱坐標(biāo)（Y），濃度（μg/ml）為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得靛藍的線性回歸方程：Y=82.7179X+9.9671，R2=0.9998，結(jié)果表明靛藍質(zhì)量濃度在0.53～6.36μg/ml的范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

4.5 精密度試驗分別精密吸取“4.1.1”項下5.3μg/ml靛藍對照品溶液 20μl，按“4.2”項下色譜條件，重復(fù)進樣6次，測得峰面積，計算RSD=0.69%（n=6）。說明儀器的精密度良好。

4.6 重現(xiàn)性試驗取樣品 （m=0.2503 g，批號170720），按“4.1.2”項下方法分別制備供試品溶液，精密吸取20μl，按“4.2”項下色譜條件進樣測定，平行操作5次。結(jié)果表明靛藍的平均含量為0.2265mg/g，RSD=0.96%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

4.7 穩(wěn)定性試驗取樣品 （m=0.2503 g，批號170720），按“4.1.2”項下方法配制供試品溶液，分別于室溫下放置 0 h，3 h，6 h，12 h，24 h 時， 精密吸取20μl，按“4.2”項下色譜條件進行測定。計算RSD=0.88%（n=5），說明在24 h內(nèi)供試品溶液基本穩(wěn)定。

4.8 加樣回收率試驗精密稱取已知含量的樣品0.25 g（批號 170720），共稱取 9份，前 3份加 5.3μg/ml的靛藍對照品溶液5.0 ml，中間3份加6.0 ml，后3份加7.0 ml，制成供試品溶液，按“4.2”項下色譜條件進行測定，結(jié)果回收率范圍為98.04%～102.00%，RSD=1.4%，說明該方法回收率良好，結(jié)果見表1。

4.9 樣品含量測定取3批樣品按“4.1.2”項下方法測定，按外標(biāo)法計算各樣品中靛藍的含量，結(jié)果見表2。

表1 加樣回收率試樣結(jié)果

表2 樣品測定結(jié)果

5 靛玉紅的含量測定

5.1 溶液的制備

5.1.1 對照品溶液的制備 取靛玉紅對照品適量，精密稱定，加N，N-二甲基甲酰胺制成每1 ml含靛玉紅2μg的溶液，即得。

5.1.2 供試品溶液的制備 取復(fù)方青黛膜1.0 g剪碎，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加N，N-二甲基甲酰胺 25 ml，超聲處理（功率 250 W，頻率 33 kHz）60 min，放冷，過濾，濾液蒸干，殘渣加 N，N-二甲基甲酰胺溶解，轉(zhuǎn)移至10 ml量瓶中，加N，N-二甲基甲酰胺至刻度，作為供試品溶液。

5.1.3 陰性對照品溶液的制備 根據(jù)樣品處方比例稱取除青黛以外的藥材，制成缺青黛的陰性制劑，再按“5.1.2”項下方法處理，即得陰性對照品溶液。

5.2 色譜條件色譜柱：Diamonsil C18（2）柱（250mm×4.6 mm，5 μm）；以甲醇-水（70∶30）為流動相；檢測波長為292 nm；柱溫為常溫；流速1.0 ml/min；進樣量為20μl；理論板數(shù)靛玉紅峰計算不低于2000。

5.3 系統(tǒng)適用性試驗分別精密吸取20μl“5.1.1、5.1.2和5.1.3”項下制備的對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液，分別按“5.2”項下色譜條件進行測定，色譜圖見圖2。

圖2 靛玉紅HPLC圖

5.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取“5.1.1”項下靛玉紅對照品貯備液適量，以N，N-二甲基甲酰胺為溶劑稀釋，得系列標(biāo)準(zhǔn)溶液， 含靛玉紅 0.21、0.42、0.84、1.68、2.10、2.52μg/ml， 分別取 20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以峰面積值為縱坐標(biāo)（Y），質(zhì)量濃度（μg/ml）為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得靛玉紅的線性回歸方程：Y=115.3048X+14.4372，R2=0.9998， 結(jié)果表明靛玉紅在0.21～2.52μg/ml的范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

5.5 精密度試驗分別精密吸取“5.1.1”項下2.1μg/ml靛玉紅對照品溶液20μl，按“5.2”項下色譜條件重復(fù)進樣6次，測定峰面積，計算RSD=0.79%（n=6）。說明儀器的精密度良好。

5.6 重現(xiàn)性試驗取樣品 （m=1.0052 g，批號170720），按“5.1.2”項下方法分別制備供試品溶液，精密吸取20μl，按“5.2”項下色譜條件進樣測定，平行操作5次。結(jié)果表明靛玉紅的平均含量為13.6309 μg/g，計，RSD=0.95%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

5.7 穩(wěn)定性試驗取樣品 （m=1.0052 g，批號170720），按“5.1.2”項下方法配制供試品溶液，分別于室溫下放置 0 h，3 h，6 h，12 h，24 h 時， 精密吸取20μl，按“5.2”項下色譜條件進行測定。計算RSD=0.96%（n=5），表明在24 h內(nèi)供試品溶液基本穩(wěn)定。

5.8 加樣回收率試驗精密稱取已知含量的樣品1.0 g（批號170720），共稱取 9份，前 3份加 2.1μg/ml的靛玉紅對照品溶液4.5 ml，中間3份加靛玉紅對照品溶液5 ml，后3份加靛玉紅對照品溶液5.5 ml。再制成供試品溶液，按“5.2”項下色譜條件測定，結(jié)果回收率范圍為98.83%～102.41%，RSD=1.27%，說明該方法回收率良好，結(jié)果見表3。

5.9 樣品含量測定取3批樣品按“5.2”項下色譜條件，計算各樣品中靛玉紅的含量，結(jié)果見表4。

表3 加樣回收率試樣結(jié)果

表4 樣品測定結(jié)果

6 討論

處方中羧甲基纖維素鈉成膜性較好，原料易得，價格便宜，甘油為增塑劑和保濕劑，增加了該膜的柔韌性，PEG6000改善了藥物分布不勻的缺點，增加了膜劑的平滑性。

靛藍與靛玉紅是青黛的主要有效成分，兩者為同分異構(gòu)體［11，12］。其中靛玉紅含量較低，為使青黛中的靛藍和靛玉紅得到充分的提取，實驗中，測定靛藍時提取液選用了氯仿，測定靛玉紅時提取液選用了N，N-二甲基甲酰胺。

該研究在選用流動相時，通過對流動相（甲醇、水）的比例進行篩選優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，流動相為甲醇∶水（60∶40）時，靛藍分離效果較好，流動相為甲醇∶水（70∶30）時，靛玉紅分離效果較好，都能達到較理想的分析要求。筆者考察了超聲處理時間（10 min、30 min、60 min）對靛藍和靛玉紅提取率的影響。結(jié)果隨著超聲處理時間的延長，樣品中靛藍和靛玉紅的提取率增加，故測定時超聲處理時間選60 min。

該流程操作制備簡單，原料易得，成本低，質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)可行，符合膜劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。