龍眼核活性脂質的分析及其細胞增殖活性研究

紀 漫，孫培冬

(江南大學 化學與材料工程學院，江蘇 無錫 214122)

活性脂質是甾醇、萜類、鞘磷脂、神經(jīng)酰胺等具有生物活性的脂溶性物質。植物甾醇被科研工作者稱為“Key to life”，具有降膽固醇、修復組織、抗炎等作用[1-2]。神經(jīng)酰胺是近年來新興的功能食品、藥品和化妝品中的活性成分，具有保濕、屏障、抗衰老和抗過敏等作用[3-4]。由于神經(jīng)酰胺在動植物中含量較少，尋求富含神經(jīng)酰胺的生物材料已經(jīng)成為神經(jīng)酰胺開發(fā)與研究的熱點。

龍眼(DimocarpuslonganLour.)俗名桂圓，是無患子科植物龍眼的果實，我國南方著名的藥食兩用水果[5]。在現(xiàn)代食品工業(yè)生產過程中，人們習慣留取龍眼肉而將龍眼核作為廢料遺棄。中藥理論認為[6]，龍眼核具有理氣、化濕、止血等功效，用于治療濕瘡、疝氣、創(chuàng)傷出血等。最近研究表明，龍眼核提取物中含有大量的生物活性物質，如多糖、類黃酮、植物甾醇和鞘磷脂等，具有降血糖、抗氧化、抗炎和抗衰老等活性[7-9]。人們對龍眼核中活性物質的研究主要集中在多糖和多酚等水溶性物質，對龍眼核中活性脂質的研究較少。

本文結合植物甾醇和神經(jīng)酰胺相似的極性等物理性質，在前期分離純化過程中，以植物甾醇含量為主要指標，監(jiān)測神經(jīng)酰胺的富集相，定性定量地檢測神經(jīng)酰胺類物質。采用CCK-8法研究龍眼核活性脂質對人皮膚成纖維細胞(HSF)和人永生化角質形成細胞(HaCaT)活性的影響，為龍眼核活性脂質作為功效性原料添加到日用化學品中提供了可行性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料與試劑

龍眼核，原產地廣西玉林，購于匯豐藥材商行；豆甾醇(純度>95%)，購自上海源葉生物科技有限公司；C16神經(jīng)酰胺(C16-CER)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，購自Sigma公司；N-油?；?植物鞘氨醇(商品級CER-3)，購自上海言臻貿易有限公司；HSF、HaCaT細胞，購自北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、pH 7.4磷酸鹽緩沖(PBS)溶液、0.25%胰酶、青霉素-鏈霉素雙抗、購自Thermo-Fisher公司；胎牛血清，購自Gibco公司；CCK-8試劑盒(500T)，購自碧云天生物技術研究所；其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設備

RE-52AA旋轉蒸發(fā)器，KH-100E型超聲波清洗器，TU-1901紫外-可見光分光光度計，NICOLEY-6700型全反射傅里葉紅外光譜儀，Ultimate 3000 RS型超高效液相層析儀，Wonda Cract ODS-2分析柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，LyoQuest Plus-85型冷凍干燥機，F(xiàn)orma3111二氧化碳培養(yǎng)箱，Synergy H4多功能酶標儀。

1.2 試驗方法

1.2.1 超聲提取龍眼核脂質粗提物

準確稱取龍眼核粉120 g于2 000 mL錐形瓶中，以95%乙醇為提取溶劑，在料液比1∶ 15、提取溫度60℃下超聲輔助提取40 min。反應結束后，抽濾得濾液，用旋轉蒸發(fā)儀旋蒸至恒重，冷凍干燥得龍眼核脂質粗提物(LNE)。按式(1)計算得率。

得率=粗提物質量/龍眼核粉質量×100%

(1)

1.2.2 分級萃取

準確稱取10.0 g LNE加入20 mL水超聲分散，置于分液漏斗中，依次用石油醚、正己烷、氯仿、正丁醇進行萃取，料液比為1∶ 10，萃取3次，合并相同溶劑萃取相，減壓濃縮后冷凍干燥得石油醚相(PEP)、正己烷相(HEP)、氯仿相(CEP)、正丁醇相(BEP)。

1.2.3 柱層析分離

采用濕法裝柱，將已經(jīng)用石油醚浸泡超聲30 min的100 g硅膠(200～300目)裝入層析柱(26 mm×500 mm)中，準確稱取1 g CEP干法上樣后進行硅膠柱層析。洗脫劑梯度依次為體積比分別為9∶ 1、7∶ 3、5∶ 5、3∶ 7、1∶ 9的石油醚-乙酸乙酯，分別洗脫200 mL，順序收集洗脫液，得到5個組分CEP-1～CEP-5。將各組分減壓濃縮，冷凍干燥后測定得率和總甾醇含量。

1.2.4 總甾醇含量測定

采用Lieberman-Burchard法測定樣品中總甾醇含量[10]。以CHCl3為溶劑，配制1.0 mg/mL豆甾醇標準溶液。分別精密吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL豆甾醇標準溶液，加入濃硫酸-乙酸酐(體積比1∶ 20)顯色劑2.0 mL，用CHCl3定容至5 mL。搖勻、超聲顯色10 min，以CHCl3為參比溶液，在710 nm處測量吸光值，試驗重復3次。以豆甾醇質量為橫坐標，以吸光值為縱坐標，繪制標準曲線。得到標準曲線回歸方程為y=1.367 1x+0.000 7，R2=0.999 7，在0.2～1.0 mg的范圍內呈良好的線性關系。

配制一定質量濃度的樣品，按上述方法測定樣品的吸光值。樣品中總甾醇含量按式(2)計算。

樣品中總甾醇含量=樣品中豆甾醇的質量×稀釋倍數(shù)/樣品質量

(2)

1.2.5 FT-IR分析

取少量冷凍干燥后的樣品，使其將傅里葉紅外光譜儀的激光探頭完全覆蓋，壓緊旋鈕，進行測試。儀器工作條件為：分辨率2 cm-1，樣品平均掃描100次，掃描范圍4 000～500 cm-1。

神經(jīng)酰胺含量的測定參照HPLC-ELSD分析方法[11]。層析柱為Wonda Cract ODS-2分析柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相A為超純水，流動相B為甲醇，先線性洗脫20 min，從97%B到100%B，再等度洗脫10 min，洗脫劑為100%B，然后進行平衡過程，溶劑為97%B；流速0.8 mL/min；柱溫30℃；進樣量5 μL；蒸發(fā)光散射檢測器漂移管溫度65℃；氣體流速1.5 mL/min。

配制質量濃度分別為0.6、0.3、0.15、0.075、0.037 5 mg/mL的系列C16-CER標準溶液，進樣量均為5 μL，進行標準曲線的繪制。取C16-CER質量M的對數(shù)(lgM)為橫坐標，峰面積S的對數(shù)(lgS)為縱坐標，繪制標準曲線。配制10.0 mg/mL的CEP-1、CEP-2、CEP-5溶液，進樣量均為5 μL，進行HPLC-ELSD分析。

根據(jù)HPLC-ELSD分析結果，C16-CER和豆甾醇的保留時間分別為17.96 min和26.82 min。C16-CER標準曲線的線性回歸方程為lgS=1.607 4 lgM+1.489 6，R2=0.996 9。相對標準偏差(RSD)為0.81%，在試驗范圍0.18～3 μg內呈良好線性關系。

1.2.7 龍眼核活性脂質成分鑒別

采用理化鑒別方法[12-13]，初步鑒別LNE、CEP、CEP-2中的有效成分，如：神經(jīng)酰胺類、三萜類、生物堿類、皂苷類、鞣質及酚類、黃酮類和有機酸類物質。其中薄層色譜[14]以氯仿-甲醇(體積比19∶ 1)為展開劑，10%磷酸-硫酸銅為顯色劑，120℃烤板10 min進行顯色反應。

1.2.8 細胞培養(yǎng)及CCK-8測定

配制含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基，將HSF和HaCaT細胞培養(yǎng)于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中。待細胞生長到90%融合時，加入0.25%胰酶消化傳代。

參照劉艷秋等[15]的方法，采用CCK-8法評估LNE、CEP、CEP-2的細胞毒性。取10～30代處于對數(shù)生長期的HSF和HaCaT細胞，分別以7.5×103、10×103個/孔的密度接種于96孔板，每孔100 μL(空白組除外)，培養(yǎng)24 h待細胞貼壁后，移去孔中培養(yǎng)液。以DMEM為溶劑，配制成不同質量濃度的樣品溶液，每孔加入100 μL樣品溶液處理24 h，以100 μL DMEM代替樣品作為對照，每組設置3個復孔。移去孔中培養(yǎng)液，用PBS沖洗兩遍，每孔加入100 μL 10% CCK-8溶液，并向不含細胞的孔中加入100 μL 10% CCK-8溶液作為空白，于培養(yǎng)箱中避光孵育1 h。孵育結束后，用酶標儀測定其在450 nm處的OD值。細胞存活率按式(3)計算。

她的堂妹妹，我見過，永久是穿著深色的衣裳，黑黑的臉，一天到晚陪著母親坐在屋子里。母親洗衣裳；她也洗衣裳，母親哭，她也哭。也許她幫著母親哭她死去的父親，也許哭的是她們的家窮。那別人就不曉得了。

細胞存活率=(OD樣品-OD空白)/(OD對照-OD空白)×100%

(3)

2 結果與討論

2.1 萃取相得率及總甾醇含量

采用超聲輔助乙醇提取法從龍眼核粉中提取活性脂質，粗提物得率為10.86%，總甾醇含量為5.28 mg/g。

各萃取相的得率及總甾醇含量如表1所示。

表1 不同萃取相得率及總甾醇含量

由表1可知，氯仿相得率最大，為34.62%，但是植物甾醇主要富集在正己烷相和氯仿相，這兩相的總甾醇含量分別為216.42 mg/g和191.95 mg/g。綜合考慮各萃取相的得率和總甾醇含量，選擇氯仿相進行硅膠柱層析分離。

2.2 硅膠柱層析分離各組分總甾醇含量

CEP經(jīng)硅膠柱層析分離后得5個組分，各組分得率及總甾醇含量見表2。

表2 硅膠柱層析分離組分得率及總甾醇含量

由表2可知，甾醇主要集中在組分CEP-2中，含量為518.26 mg/g，其次甾醇含量較高的組分為CEP-1，甾醇含量最少的組分為CEP-5。因此對這3個組分進行HPLC-ELSD檢測，以驗證甾醇含量與神經(jīng)酰胺含量之間的關系。

2.3 FT-IR分析

CEP-2的FT-IR分析結果如圖1所示。

圖1 CEP-2的FT-IR圖譜

2.4 HPLC-ELSD分析

CEP-1、CEP-2和CEP-5的HPLC-ELSD圖譜如圖2所示。

由圖2可知：CEP-1在豆甾醇保留時間27 min左右僅有一個較小的峰出現(xiàn)，但在神經(jīng)酰胺的保留時間18 min左右并沒有出現(xiàn)峰；CEP-5中未檢出神經(jīng)酰胺和甾醇類物質；CEP-2在27 min附近出現(xiàn)了一個平頭峰，表明CEP-2中甾醇含量較高，同時在18 min左右出現(xiàn)了一個小峰，表明CEP-2中含神經(jīng)酰胺類物質。由TLC分析結果可知，C16-CER和豆甾醇的比移值分別為0.482、0.727；將這3個物質進行TLC定性分析，CEP-1僅在比移值0.482處出現(xiàn)了顏色較淺的點，CEP-5在比移值0.482和0.727處均未出現(xiàn)點，CEP-2在比移值0.482和0.727處均出現(xiàn)了點。綜合HPLC-ELSD和TLC分析結果可知，以上3種物質，CEP-2中植物甾醇含量最高，神經(jīng)酰胺含量也最高。根據(jù)C16-CER標準曲線所得的線性方程，得CEP-2中神經(jīng)酰胺的含量為2.65 mg/g。

圖2 CEP-1、CEP-2、CEP-5的HPLC-ELSD圖譜

2.5 龍眼核活性成分檢識

為了進一步定性地驗證龍眼核提取純化各組分的活性成分，對LNE、CEP、CEP-2中的活性成分進行鑒別，結果如表3所示。

表3 龍眼核活性成分鑒別結果

注：檢識結果中“+”表示有現(xiàn)象，“-”表示無明顯現(xiàn)象。

由表3可知:LNE和CEP中所含的物質類似，含有三萜類、生物堿類、皂苷類、鞣質及酚類、黃酮類和有機酸類，但由于氯仿的極性比乙醇小，所以經(jīng)過氯仿萃取后，除去了親水性的生物堿類及苷類；CEP-2中含三萜類、神經(jīng)酰胺類、鞣質及酚類物質。LNE和CEP通過TLC定性分析，未檢測出神經(jīng)酰胺類物質，而CEP-2中檢測出神經(jīng)酰胺類物質，說明龍眼核脂質粗提物中神經(jīng)酰胺類物質的含量較低，通過硅膠柱層析，富集了活性脂質中的神經(jīng)酰胺類物質。

2.6 CCK-8細胞增殖活性

為確保樣品的安全性，采用CCK-8法測定不同質量濃度LNE、CEP、CEP-2及商品級CER-3對HSF和HaCaT細胞存活率的影響，結果分別見圖3、圖4。以僅含DMEM的培養(yǎng)基作為對照組，細胞的活力設定為100%。

圖3和圖4中*代表采用ANOVA-Tukey相關性分析計算出的p值(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。

圖3 不同樣品處理的HSF細胞活力評估

由圖3A可知，當樣品的質量濃度為125 μg/mL時，LNE處理的HSF細胞的存活率為85.27%(p<0.01)，CEP處理的HSF細胞存活率為89.35%(p<0.01)。由圖3B可知，CEP-2在試驗范圍20～100 μg/mL內，對HSF細胞均沒有毒副作用，存活率均大于93%。說明隨著樣品中植物甾醇和神經(jīng)酰胺的富集，相同質量濃度的樣品處理的HSF細胞存活率增加。當CER-3質量濃度為40 μg/mL，HSF細胞的存活率為112.26%(p<0.01)，說明神經(jīng)酰胺能促進HSF細胞增殖；40 μg/mL的CEP-2處理的HSF細胞的存活率為105.28%，推測原因是CEP-2中神經(jīng)酰胺的種類和含量與CER-3不同，對HSF細胞的增殖作用不明顯。

由圖4A可知，LNE對HaCaT細胞無增殖活性，而CEP質量濃度為60 μg/mL時，對HaCaT細胞具有輕微的增殖作用，細胞存活率為105.09%。由圖4B可知，CEP-2在試驗范圍20～200 μg/mL內，對HaCaT細胞均沒有毒副作用，細胞存活率均大于95.29%，且當CEP-2質量濃度為100 μg/mL時，HaCaT細胞的存活率最大，為114.21%(p<0.001)。說明分離純化后的活性脂質有助于HaCaT細胞的生長增殖。80 μg/mL的CER-3處理的HaCaT細胞，細胞存活率為116.67%；純化后的活性脂質CEP-2與商品級CER-3對HaCaT細胞的增殖作用相當。

3 結 論

通過超聲輔助乙醇提取法得到龍眼核脂質粗提物，經(jīng)氯仿萃取和硅膠柱層析分離得到活性脂質CEP-2，其主要成分為三萜類、神經(jīng)酰胺類、鞣質及酚類物質，總甾醇含量為518.26 mg/g，神經(jīng)酰胺含量為2.65 mg/g。根據(jù)CCK-8細胞增殖試驗可知，40 μg/mL CEP-2對HSF細胞具有輕微的增殖作用，細胞存活率為105.28%；100 μg/mL CEP-2對HaCaT細胞的增殖作用較明顯，細胞存活率為114.21%(p<0.001)，且其與商品級CER-3對HaCaT細胞的增殖活性相當。本文定性定量地檢測龍眼核中的神經(jīng)酰胺，為龍眼核作為制備神經(jīng)酰胺的原料提供了研究方向，也為神經(jīng)酰胺的分離鑒定提供了一種簡單、安全有效的方法；同時表明龍眼核活性脂質有望作為功效性成分添加于日用化學品中。