酶法合成中長(zhǎng)碳鏈甘油三酯

徐文迪，繆智誠(chéng)，王小三，金青哲，王興國(guó)

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇省食品安全與質(zhì)量控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫 214122)

中碳鏈脂肪酸是含有6～12個(gè)碳原子的脂肪酸，在人乳脂中的含量為7%～13%[1-3]。人乳脂中大部分的中碳鏈脂肪酸與長(zhǎng)碳鏈脂肪酸結(jié)合形成中長(zhǎng)碳鏈甘油三酯(MLCT)，約占人乳甘油三酯總量的20%[4-5]。MLCT消化吸收速度快[6-7]，能為嬰兒快速提供能量，還能補(bǔ)充必需脂肪酸。此外，MLCT水解產(chǎn)生的中碳鏈脂肪酸及其單甘酯還具有較強(qiáng)的抑菌和抗病毒活性[8-9]。相關(guān)研究[10-11]表明，中碳鏈脂肪酸及其單甘酯能促進(jìn)乳桿菌和雙歧桿菌的生長(zhǎng)，其特定的抗菌活性會(huì)影響嬰兒早期腸道菌群的建立。

嬰兒配方奶粉中通常以添加椰子油的形式補(bǔ)充中碳鏈脂肪酸，其所含的中碳鏈甘油三酯與人乳脂中的MLCT存在較大差異[4-5,12]。目前國(guó)內(nèi)外雖已有大量合成MLCT的研究[13-15]，但是合成與人乳脂結(jié)構(gòu)相似的MLCT的報(bào)道尚少。人乳脂中的中碳鏈脂肪酸以月桂酸為主[1-3]，而此前研究較多的是辛酸和癸酸。月桂酸的抗菌活性是中碳鏈脂肪酸中最強(qiáng)的[10]，與辛酸和癸酸相比更有利于增強(qiáng)嬰兒對(duì)病原體的抵抗力。人乳脂中的MLCT可以分為單中碳鏈甘油三酯(LLM)和雙中碳鏈甘油三酯(MML)，ECN(當(dāng)量碳原子數(shù))的分布范圍為36～46，集中分布在38～44，其中含量較高的MLCT有OPLa、LPLa、OLaO、LLaO、OMLa、OPCa、LPCa、LLLa、OLaLa及LLaLa[4-5]。

本研究以富含中碳鏈脂肪酸的椰子油和實(shí)驗(yàn)室制備的富含OPO和OPL的油脂為原料，采用脂肪酶NS40086為催化劑，酶法合成和人乳甘油三酯結(jié)構(gòu)相似的MLCT。由于ECN為36、46可能會(huì)混入未完全反應(yīng)的中碳鏈甘油三酯和長(zhǎng)碳鏈甘油三酯，因此本研究選擇ECN 為38～44的MLCT的含量作為優(yōu)化指標(biāo)，確定酶法酯交換合成MLCT的最優(yōu)條件。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

棕櫚硬脂(熔點(diǎn)58℃)，益海嘉里有限公司；椰子油，東海糧油工業(yè)(張家港)有限公司；油酸(85%)，阿拉丁有限公司；脂肪酶NS40086，諾維信生物技術(shù)有限公司；豬胰脂酶，Sigma- Aldrich (中國(guó))公司；亞油酸(65%)、無水乙醚、甲醇、正己烷、膽酸鈉、氯化鈣、無水硫酸鈉、氫氧化鉀、鹽酸、乙酸，分析純；乙腈、異丙醇、正己烷，色譜純。

Agilent 7820A氣相色譜儀、Agilent 1260高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；Alltech 3300蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，美國(guó)Grace公司；Waters 1525 高效液相色譜儀、2414型示差檢測(cè)器、Waters Acquity UPLC、Waters Xevo G2-S Q-TOF質(zhì)譜儀，沃特世科技有限公司；KDL2短程分子蒸餾設(shè)備，德國(guó)UIC公司；HH-601恒溫水浴鍋；RT 10磁力攪拌器。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酶法合成富含OPO和OPL的結(jié)構(gòu)脂

溶劑法分提棕櫚硬脂：58℃棕櫚硬脂按1∶ 5加入丙酮，于60℃下充分溶解，在38℃下結(jié)晶3 h，抽濾得到高熔點(diǎn)棕櫚硬脂，旋蒸除去丙酮。

將分提后的棕櫚硬脂與油酸、亞油酸按摩爾比1∶ 8∶ 4混合，加入底物總質(zhì)量8%的脂肪酶NS40086，60℃下磁力攪拌反應(yīng)4 h，反應(yīng)結(jié)束后離心除去脂肪酶，加入1.5倍中和游離脂肪酸所需的0.5 mol/L KOH-乙醇溶液脫除游離脂肪酸[16]，得到富含OPO和OPL的結(jié)構(gòu)脂。

1.2.2 酶法合成中長(zhǎng)碳鏈甘油三酯

將制備得到的富含OPO和OPL的結(jié)構(gòu)脂與椰子油(底物)按照一定的摩爾比混合，加入一定量的脂肪酶NS40086，在一定溫度下磁力攪拌反應(yīng)一段時(shí)間，反應(yīng)結(jié)束后離心除去脂肪酶，得到富含MLCT的產(chǎn)物。

1.2.3 分子蒸餾純化酯交換產(chǎn)物

分子蒸餾條件：蒸發(fā)面溫度210℃，壓力1 Pa，進(jìn)料速率2.5 mL/min，刮板轉(zhuǎn)速120 r/min，冷凝器溫度30℃。

1.2.4 總脂肪酸組成分析

脂肪酸甲酯的制備： 40 mg油樣加入2 mL正己烷，然后加入0.5 mL KOH-CH3OH溶液(2 mol/L)，振蕩1 min，取上清液加入無水硫酸鈉，過0.22 μm有機(jī)濾膜后進(jìn)氣相色譜儀分析。

氣相色譜條件：Trace TR-FAME色譜柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm，Thermo Fisher Scientific)；氫火焰離子化檢測(cè)器，檢測(cè)器和進(jìn)樣口的溫度均為250℃；升溫程序?yàn)槌跏贾鶞?00℃，保留1 min，以5℃/min的速率升溫到220℃，保留15 min。

1.2.5 sn-2位脂肪酸組成分析

取100 mg樣品加入2 mL Tris-HCl緩沖液(pH 7.6)、0.5 mL 0.05%膽酸鹽溶液、0.2 mL 2.2%CaCl2溶液及20 mg豬胰脂肪酶，旋渦振蕩1 min。置于40℃水浴中反應(yīng)6 min，每3 min取出振蕩30 s。反應(yīng)結(jié)束后加入1 mL 6 mol/L鹽酸和2 mL乙醚，振蕩，5 000 r/min離心3 min，取上清液氮吹至約300 μL。樣品進(jìn)行薄層色譜層析，展開劑為正己烷-乙醚-乙酸(體積比50∶ 50∶ 1)。刮取sn-2-單甘酯條帶，用乙醚萃取并用氮?dú)獯蹈伞＜柞セ幚矸椒ê蜌庀嗌V分析條件同1.2.4。

1.2.6 甘油三酯組成分析

RP-HPLC-ELSD分析甘油三酯組成。樣品溶于正己烷中，質(zhì)量濃度20 mg/mL，進(jìn)樣量10 μL。色譜條件：Lichrospher C18色譜柱(250 mm × 4.6 mm × 5 μm)，柱溫30℃；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為異丙醇，流速0.8 mL/min，梯度洗脫程序?yàn)?～40 min 60%A，45～85 min 55%A，90 min 60%A；霧化室溫度55℃；氣體流速1.8 L/min；增益1。

NP-HPLC分析甘油酯、游離脂肪酸含量。采用配備有Sepax HP-Silica硅膠柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)和示差檢測(cè)器的液相色譜儀分析。樣品溶于正己烷中，質(zhì)量濃度20 mg/mL，進(jìn)樣量20 μL。色譜條件：柱溫35℃；流動(dòng)相為正己烷-異丙醇-甲酸(體積比15∶ 1∶ 0.03)，流速1 mL/min。

UPLC-Q-TOF-MS鑒定甘油三酯構(gòu)型。采用配備BEH C18柱(2.1mm×50 mm, 1.9 μm)和四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀的超高效液相色譜系統(tǒng)分析。色譜及質(zhì)譜條件參考Zhang等[17]的方法。結(jié)果中表示的甘油三酯構(gòu)型未區(qū)分位置異構(gòu)體。

2 結(jié)果與討論

2.1 反應(yīng)底物的甘油三酯組成

椰子油和實(shí)驗(yàn)室制備的富含OPO和OPL的結(jié)構(gòu)脂的甘油三酯組成如表1、表2所示。

表1 椰子油的甘油三酯組成 %

注：Cy. C8∶ 0; Ca. C10∶ 0; La. C12∶ 0; M. C14∶ 0; P. C16∶ 0; S. C18∶ 0; O. C18∶ 1; L. C18∶ 2。下同。

表2 富含OPO和OPL結(jié)構(gòu)脂的甘油三酯組成 %

由表1、表2可知，椰子油的甘油三酯中含有較多的LaLaLa、LaLaCa、LaLaM等，而富含OPO和OPL的結(jié)構(gòu)脂的主要甘油三酯類型為OPO、OPL、PPO和PPL。采用sn-1,3位特異性的脂肪酶催化兩種油脂的酯交換反應(yīng)，可得到與人乳脂結(jié)構(gòu)類似的MLCT，如OPLa、LPLa、OLaO、LLaO、OMLa、OPCa、LPCa、LLLa、OLaLa及LLaLa等。

2.2 反應(yīng)體系的確定

酯交換反應(yīng)分別在無溶劑體系和溶劑體系中進(jìn)行，探究反應(yīng)體系對(duì)產(chǎn)物中MLCT含量的影響。無溶劑體系：將富含OPO和OPL的結(jié)構(gòu)脂與椰子油按照底物摩爾比1∶ 1混合，加入底物總質(zhì)量8%的脂肪酶，在60℃下進(jìn)行反應(yīng)。溶劑體系：加入3 mL正己烷，其他條件與無溶劑體系相同。產(chǎn)物經(jīng)RP-HPLC-ELSD分析，結(jié)果如圖1所示。

圖1 反應(yīng)體系對(duì)產(chǎn)物中MLCT含量的影響

由圖1可以看出，溶劑體系與無溶劑體系相比，初始反應(yīng)速率快，在2～4 h內(nèi)MLCT含量高于無溶劑體系。這是由于溶劑體系中加入了正己烷，降低了體系的黏度，增加了反應(yīng)底物之間的傳質(zhì)和熱傳遞，有利于酯交換反應(yīng)的進(jìn)行。但是在反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)，兩者的MLCT含量沒有顯著性差異，并且無溶劑體系在相同的反應(yīng)容器中有更高的反應(yīng)體積，同時(shí)省去除去正己烷的步驟，可以節(jié)約成本，提高生產(chǎn)效率，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。綜合考慮，選擇無溶劑體系進(jìn)行后續(xù)反應(yīng)。

2.3 底物摩爾比的影響

將富含OPO和OPL的結(jié)構(gòu)脂與椰子油(底物)以不同的摩爾比混合，加入底物總質(zhì)量8%的脂肪酶，在60℃下進(jìn)行酶催化反應(yīng)，探究底物摩爾比對(duì)產(chǎn)物中MLCT含量的影響。產(chǎn)物經(jīng)RP-HPLC-ELSD分析，結(jié)果如圖2所示。

圖2 底物摩爾比對(duì)產(chǎn)物中MLCT含量的影響

由圖2可以看出，當(dāng)?shù)孜锬柋葹?.5∶ 1時(shí)，MLCT含量在反應(yīng)過程中始終低于其他4組。這是由于底物中的長(zhǎng)碳鏈甘油三酯的含量偏多，沒有足夠的中碳鏈甘油三酯與之反應(yīng)，導(dǎo)致產(chǎn)物中的MLCT含量偏低。與之類似，反應(yīng)底物中的中碳鏈甘油三酯含量過剩，也會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物中MLCT的含量偏低。當(dāng)?shù)孜锬柋葹?.8∶ 1時(shí)，產(chǎn)物中MLCT含量最高。因此，選擇底物摩爾比0.8∶ 1進(jìn)行后續(xù)反應(yīng)。

2.4 反應(yīng)溫度的影響

反應(yīng)溫度是影響酯交換反應(yīng)的重要因素，溫度會(huì)影響酶的催化活性及穩(wěn)定性，還會(huì)影響反應(yīng)體系的傳質(zhì)[18]，尤其是在無溶劑體系中。本研究在底物摩爾比0.8∶ 1，加入底物總質(zhì)量8%的脂肪酶，反應(yīng)溫度50～70℃下進(jìn)行反應(yīng)，探究反應(yīng)溫度對(duì)產(chǎn)物中MLCT含量的影響。產(chǎn)物經(jīng)RP-HPLC-ELSD分析，結(jié)果如圖3所示。

圖3 反應(yīng)溫度對(duì)產(chǎn)物中MLCT含量的影響

由圖3可以看出，MLCT含量隨著反應(yīng)溫度的升高而增加。反應(yīng)在6 h時(shí)趨于平衡，此時(shí)65℃條件下的產(chǎn)物中MLCT含量達(dá)到了70.44%，高于50、55℃及60℃反應(yīng)條件下MLCT含量。這是由于較高的溫度有利于降低反應(yīng)體系的黏度，增加底物間的相互作用，加快酯交換反應(yīng)進(jìn)程[19]，從而提高產(chǎn)物中MLCT含量。當(dāng)反應(yīng)溫度從65℃繼續(xù)升高到70℃時(shí)，在反應(yīng)初期，70℃條件下產(chǎn)物中MLCT的含量較高，但在反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)，兩者沒有出現(xiàn)顯著性差異。雖然高溫能夠增加反應(yīng)的初始速率，但會(huì)影響酶的穩(wěn)定性和使用壽命，同時(shí)也會(huì)增加能耗。綜合考慮，選擇65℃作為最佳反應(yīng)溫度進(jìn)行后續(xù)反應(yīng)。

2.5 加酶量的影響

在底物摩爾比0.8∶ 1條件下，加入不同量的脂肪酶，于65℃下進(jìn)行酯交換反應(yīng)，探究加酶量對(duì)產(chǎn)物中MLCT含量的影響。產(chǎn)物經(jīng)RP-HPLC-ELSD分析，結(jié)果如圖4所示。

圖4 加酶量對(duì)產(chǎn)物中MLCT含量的影響

由圖4可知，當(dāng)加酶量在4%～8%的范圍內(nèi)時(shí)，產(chǎn)物中的MLCT含量隨著加酶量的增加而增多。加酶量為8%～12%比加酶量4%和6%先達(dá)到反應(yīng)平衡，這是由于當(dāng)加酶量較低時(shí)，沒有足夠的酶與底物接觸，導(dǎo)致反應(yīng)速度慢，反應(yīng)達(dá)到平衡的時(shí)間長(zhǎng)；隨著加酶量的增多，酶與底物的接觸頻率增加，從而加速酯交換反應(yīng)[20]。加酶量還會(huì)影響反應(yīng)體系的傳質(zhì)阻力，當(dāng)其對(duì)傳質(zhì)阻力的影響大于對(duì)反應(yīng)速率的影響時(shí)，繼續(xù)增加加酶量對(duì)反應(yīng)的影響不大，這與加酶量從8%增加到12%時(shí)MLCT含量沒有出現(xiàn)顯著性差異這一結(jié)果相符。為了提高產(chǎn)物中MLCT含量，同時(shí)考慮到成本因素，最終選擇8%作為最優(yōu)的加酶量。此時(shí)，反應(yīng)在6 h時(shí)已達(dá)到平衡。最優(yōu)條件下，產(chǎn)物中的MLCT含量為70.44%。

2.6 產(chǎn)物的脂肪酸組成

原料和最優(yōu)條件下得到的酯交換產(chǎn)物的脂肪酸組成如表3所示。

表3 原料及產(chǎn)物的脂肪酸組成 %

由表3可知：酯交換產(chǎn)物同時(shí)含有中碳鏈脂肪酸和長(zhǎng)碳鏈脂肪酸，其中總脂肪酸含量最高的依次為月桂酸、棕櫚酸和油酸，這與3種脂肪酸在原料油中的含量較高有關(guān)；sn-2位脂肪酸中含量最高的脂肪酸為棕櫚酸，其次是月桂酸，主要是由于兩種原料油脂的sn-2位分別含有高含量的棕櫚酸和月桂酸，經(jīng)sn-1,3位特異性脂肪酶催化的酯交換反應(yīng)后，這兩種脂肪酸在sn-2位仍保留較高的含量。

2.7 分子蒸餾純化酯交換產(chǎn)物

采用NP-HPLC分析分子蒸餾前后產(chǎn)物中的游離脂肪酸(FFA)、甘油二酯(DAG)及甘油三酯(TAG)的含量，結(jié)果如表4所示。

表4 分子蒸餾前后產(chǎn)物的甘油酯組成 %

由表4可知，經(jīng)過分子蒸餾之后，產(chǎn)物中的甘油三酯含量從86.07%提高到了97.22%，甘油二酯和游離脂肪酸含量大大降低，表明分子蒸餾對(duì)甘油二酯和游離脂肪酸具有良好的分離效果。

采用UPLC-Q-TOF-MS對(duì)分子蒸餾后產(chǎn)物的甘油三酯進(jìn)行分析，結(jié)果如表5所示。

表5 分子蒸餾后產(chǎn)物的甘油三酯組成

續(xù)表5

甘油三酯[M+NH4]+(m/z)[DAG]+(m/z)含量/%OPL874.73575.47577.48601.492.99±0.24OMO848.73549.47549.47603.512.87±0.13PPL848.73575.47575.47551.490.54±0.09OPM822.69523.44549.47603.514.63±0.18PPM796.69523.44523.44551.463.19±0.11OOO902.77603.53603.53603.530.92±0.05OPO876.74577.48577.48603.513.98±0.15PPO850.73551.48577.48577.484.46±0.18PPP824.73551.47551.47551.471.99±0.11POS878.77577.51579.51605.531.00±0.07PPS852.76551.48579.51579.510.64±0.05OOS904.85605.53605.53603.530.35±0.07

由表5可知，產(chǎn)物中共有44種甘油三酯，與原料中的甘油三酯類型和含量有很大差異，除了部分原料油中原有的中碳鏈甘油三酯和長(zhǎng)碳鏈甘油三酯外，還生成了大量的MLCT。根據(jù)文獻(xiàn)[1-2,4-5]報(bào)道，OPLa是人乳脂中含量最高的MLCT，其在酯交換產(chǎn)物中的含量也最高，而原料中OPLa的含量很低，表明酯交換反應(yīng)生成了OPLa，達(dá)到了預(yù)期的效果。其次，酯交換產(chǎn)物中還含有一些人乳脂中含量較高的其他MLCT，如LPLa、LLaO、OLaO、OMLa、OPCa、OLaLa等，其中LPLa、LLaO、OPCa是新生成的甘油三酯，椰子油中雖含有OLaO，但是含量極低，經(jīng)過酯交換反應(yīng)之后，OLaO的含量大幅提高。分子蒸餾之后，在人乳脂中含量較高的幾種MLCT(OPLa、LPLa、OLaO、LLaO、OPCa、OMLa、LLLa、OLaLa、LLaLa)的總含量達(dá)到37.25%，其中LPLa、LLaO、OLaO的含量達(dá)到4.56%、3.76%和5.99%。

3 結(jié) 論

本研究以實(shí)驗(yàn)室制備的富含OPO和OPL的結(jié)構(gòu)脂與椰子油為原料酶法合成與人乳脂中結(jié)構(gòu)相似的中長(zhǎng)碳鏈甘油三酯(MLCT)。得到的最佳反應(yīng)條件為：底物摩爾比0.8∶ 1，反應(yīng)溫度65℃，脂肪酶NS40086添加量8%，反應(yīng)時(shí)間6 h，無溶劑體系。最佳條件下得到的產(chǎn)物中MLCT含量為70.44%。產(chǎn)物經(jīng)分子蒸餾純化之后，甘油三酯的含量可達(dá)97.22%，其中OPLa、LPLa、OLaO、LLaO、OPCa、OMLa、LLLa、OLaLa、LLaLa均是人乳脂中含量較高的MLCT。產(chǎn)物中OPLa含量最高，達(dá)6.69%。這種模擬人乳脂MLCT結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)有潛力應(yīng)用于嬰兒配方奶粉中，使嬰兒配方奶粉的脂質(zhì)組成更加接近人乳。