亞麻籽提取物對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠的抗氧化保護(hù)機(jī)制研究

王 榮，楊 寬，陳春妮，趙雪儒，袁啟恒，秦 蓓

(西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，西安 710021)

亞麻又稱(chēng)胡麻，是最古老的纖維作物之一，也是世界十大油料作物的一種[1]。亞麻籽中含有油脂、蛋白質(zhì)、木酚素、維生素、黃酮等多種成分[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，亞麻籽提取物具有降血壓、調(diào)血脂、抗癌等多種功效[3]。目前亞麻籽的主要臨床應(yīng)用局限在腸燥便秘、皮膚干燥瘙癢和毛發(fā)枯萎脫落等方面[4]。因此，有必要對(duì)亞麻籽的藥理活性進(jìn)行深入研究。

衰老是生物體隨著時(shí)間推移出現(xiàn)的不可逆退行性改變。自由基學(xué)說(shuō)是目前衰老公認(rèn)的且研究最為廣泛的學(xué)說(shuō)。天然產(chǎn)物能夠清除自由基減弱機(jī)體的氧化損傷[5]。已有文獻(xiàn)報(bào)道，亞麻籽提取物具有抗氧化作用[6]，對(duì)CCl4和D-半乳糖胺所致的小鼠急性肝損傷具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與其清除自由基、提高抗氧化能力有關(guān)[4，7]。目前關(guān)于亞麻籽提取物的抗衰老研究鮮有報(bào)道。本研究擬采用D-半乳糖皮下注射建立小鼠亞急性衰老模型，測(cè)定小鼠全血和組織(腦、肝、腎)中丙二醛(MDA)含量和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)活性的變化，全面評(píng)價(jià)亞麻籽提取物在衰老小鼠體內(nèi)的抗氧化作用，為亞麻籽提取物的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

亞麻籽提取物，購(gòu)自陜西嘉禾植物化工有限責(zé)任公司，HPLC法檢測(cè)亞麻木酚素含量為40%；D-半乳糖，購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)為H20J9C53453；過(guò)氧化氫酶(CAT)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)試劑盒和BCA試劑盒，購(gòu)自南京建成生物工程研究所。體重(20±2)g的清潔級(jí)雄性昆明小鼠50只，購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(川)2015-030。

1510自動(dòng)全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo Fisher Scientific；YP50001電子分析天平，美國(guó)OHAUS；Biofuge Stratos高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Thermo Fisher Scientific；恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；T10微量組織勻漿器，艾卡儀器設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模及分組

本實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)西安醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物常規(guī)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為自然光照，12 h晝夜交替，溫度(20±2)℃，相對(duì)濕度為50%～70%，顆粒飼料喂養(yǎng)，自由攝食飲水。小鼠經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后分組進(jìn)行處理。50只小鼠，隨機(jī)取10只設(shè)為正常組，其余40只頸部皮下注射D-半乳糖[8]，給藥劑量為500 mg/kg，小鼠注射體積0.1 mL/10 g，每日1次，連續(xù)注射8周。正常組注射生理鹽水。

造模8周后，將40只模型小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只，分別設(shè)為模型組，亞麻籽提取物高、中、低劑量組。小鼠灌胃給藥，灌胃體積0.1 mL/10 g，每日1次，連續(xù)給藥6周。亞麻籽提取物組給藥劑量分別為600、300 mg/kg和150 mg/kg，正常組和模型組給予生理鹽水。灌胃同時(shí)，正常組頸部皮下注射生理鹽水，其余小鼠繼續(xù)頸部皮下注射D-半乳糖。

1.2.2 指標(biāo)檢測(cè)

末次給藥后，小鼠禁食24 h后，眼眶采血，血液抗凝，按試劑盒方法制備溶血液，測(cè)定全血中CAT、SOD、GSH-Px活力和MDA含量。小鼠脫頸處死，解剖迅速取小鼠胸腺和脾臟計(jì)算臟器指數(shù)；另取出肝、腦和腎，按質(zhì)量與體積比1∶ 9加入生理鹽水，冰浴勻漿，制備10%組織勻漿液，2 500 r/min離心10 min，取上清液，按試劑盒方法分別測(cè)定各組織勻漿液中CAT、SOD、GSH-Px活力和MDA含量。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析，多組間比較采用Oneway-Anova Dunnett雙側(cè)t檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞麻籽提取物對(duì)衰老小鼠胸腺和脾臟指數(shù)的影響(見(jiàn)表1)

表1 亞麻籽提取物對(duì)衰老小鼠胸腺和脾臟指數(shù)的影響

注：與正常組比較，**P<0.01，*P<0.05；與模型組比較，##P<0.01，#P<0.05。下同。

脾臟是外周免疫器官之一，胸腺是重要的淋巴器官，因此脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)能反映小鼠的衰老狀態(tài)。由表1可知，模型組小鼠脾臟指數(shù)提高，而胸腺指數(shù)降低，與正常組比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，表明造模成功。與模型組相比，亞麻籽提取物高劑量組能顯著降低小鼠的脾臟指數(shù)，提高胸腺指數(shù)(P<0.05)。

2.2 亞麻籽提取物對(duì)衰老小鼠全血和組織中MDA含量的影響(見(jiàn)表2)

表2 亞麻籽提取物對(duì)衰老小鼠全血和組織中MDA含量的影響

MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物，被認(rèn)為是衰老的指標(biāo)，MDA含量隨著衰老而增加。由表2可知，與正常組相比，模型組小鼠全血和組織(腦、肝和腎)中MDA含量顯著增加(P<0.01)，說(shuō)明造模成功。亞麻籽提取物高、中、低劑量組小鼠全血中MDA含量顯著低于模型組，高劑量組和中劑量組小鼠組織中MDA含量與模型組具有顯著差異(P<0.05)。以上結(jié)果表明，亞麻籽提取物能降低衰老小鼠腦、肝和腎臟以及全血中MDA含量，且對(duì)全血的影響最顯著。

2.3 亞麻籽提取物對(duì)衰老小鼠全血和組織中SOD活力的影響(見(jiàn)表3)

表3 亞麻籽提取物對(duì)衰老小鼠全血和組織中SOD活力的影響

SOD是機(jī)體抗氧化酶系中一類(lèi)重要的抗氧化酶，對(duì)超氧陰離子自由基具有清除作用，進(jìn)而減少脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。SOD的活力能反映機(jī)體清除氧自由基的能力。由表3可知，與正常組相比，模型組小鼠全血和組織(腦、肝和腎)中SOD的活力顯著降低(P<0.05或P<0.01)。與模型組相比，亞麻籽提取物高劑量組和中劑量組顯著提高了小鼠全血中SOD的活力；亞麻籽提取物3個(gè)劑量組均顯著增加了小鼠腦和肝組織中SOD活力；高劑量組顯著提高了小鼠腎組織中SOD的活力。結(jié)果表明，亞麻籽提取物能提高衰老小鼠全血和組織中SOD的活力。

2.4 亞麻籽提取物對(duì)衰老小鼠全血和組織中CAT活力的影響(見(jiàn)表4)

表4 亞麻籽提取物對(duì)衰老小鼠全血和組織中CAT活力的影響

CAT亦是機(jī)體重要的抗氧化酶系，具有分解過(guò)氧化氫的作用，可阻斷脂質(zhì)過(guò)氧化的一級(jí)引發(fā)反應(yīng)。由表4可知，模型組小鼠全血和腦、肝、腎中CAT的活力較正常組顯著降低(P<0.05或P<0.01)。小鼠腦和全血中亞麻籽提取物3個(gè)劑量組的CAT活力與模型組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；亞麻籽提取物高劑量組顯著提高了小鼠肝和腎中CAT活力(P<0.05)。

2.5 亞麻籽提取物對(duì)衰老小鼠全血和組織中GSH-PX活力的影響(見(jiàn)表5)

表5 亞麻籽提取物對(duì)衰老小鼠全血和組織中GSH-Px活力的影響

GSH-Px通過(guò)催化GSH還原過(guò)氧化物，進(jìn)而抑制活性氧的生成。由表5可知，與正常組相比，模型組小鼠全血和腦、肝、腎中GSH-Px活力顯著降低(P<0.01)。亞麻籽提取物高劑量組的小鼠組織中的GSH-Px活力與模型組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；亞麻籽提取物高劑量組和中劑量組能顯著提高衰老小鼠全血中GSH-Px活力(P<0.05)。

2.6 討論

衰老模型的建立是本研究的第一步。D-半乳糖皮下注射是衰老造模的經(jīng)典方法。過(guò)多的D-半乳糖在醛糖還原酶的催化下，生成半乳糖醇，而半乳糖醇不能被代謝，堆積在細(xì)胞內(nèi)的半乳糖醇導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、代謝紊亂，最終誘導(dǎo)細(xì)胞衰老。本研究以D-半 乳糖連續(xù)小鼠頸部皮下注射8周建立衰老模型。胸腺是重要的免疫器官，衰老小鼠的胸腺較其他臟器更易出現(xiàn)萎縮[9]。脾臟是外周的免疫器官，脾腫大是腫瘤等疾病的征兆[8]。由研究結(jié)果可知，本研究中模型小鼠胸腺指數(shù)降低、脾臟指數(shù)增加。MDA通常被作為衰老模型測(cè)定的指標(biāo)，通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，模型小鼠全血和3個(gè)重要臟器MDA的含量顯著增加，表明衰老小鼠模型造模成功。

衰老伴隨著心血管、老年癡呆、糖尿病等多種退行性疾病，嚴(yán)重威脅生命。衰老自由基學(xué)說(shuō)于1956年首次由Harman提出。大量研究表明，機(jī)體內(nèi)自由基的不斷蓄積與衰老的發(fā)生機(jī)制有關(guān)[10]。機(jī)體氧代謝過(guò)程中所產(chǎn)生的活性氧過(guò)多或其清除速率降低會(huì)加速衰老并引發(fā)如癌癥、心血管疾病、老年癡呆等各種退行性疾病。因此，抗衰老藥物的研發(fā)主要針對(duì)以下3個(gè)方面：①直接清除自由基；②抑制脂質(zhì)過(guò)氧化；③提高抗氧化酶活力。本研究所用的亞麻籽提取物中亞麻木酚素含量高達(dá)40%，已有研究報(bào)道木酚素具有抗氧化作用[4，11]。本研究結(jié)果顯示，亞麻籽提取物可降低小鼠全血和肝、腎、腦中MDA含量，增加SOD、CAT和GSH-Px的活力，特別是高劑量組的各項(xiàng)指標(biāo)與模型組相比有顯著差異，提示亞麻籽提取物可通過(guò)抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)和激活體內(nèi)抗氧化酶系發(fā)揮對(duì)衰老小鼠的保護(hù)作用。

3 結(jié) 論

本文研究了亞麻籽提取物對(duì)D-半乳糖所致衰老小鼠的體內(nèi)抗氧化作用。結(jié)果顯示，亞麻籽提取物高劑量組(600 mg/kg)能顯著降低小鼠的脾臟指數(shù)，提高小鼠的胸腺指數(shù)，顯示出對(duì)衰老小鼠的保護(hù)作用。這種保護(hù)作用可能與亞麻籽提取物降低小鼠全血和組織(胸、肝、腎)中MDA的含量，增加SOD、CAT和GSH-Px活力有關(guān)。