蛋白芯片法同時(shí)檢測(cè)食品中克倫特羅與萊克多巴胺的殘留量

李周敏，王 穎，冷寒雪，李心愛，康 希

(1.南京大學(xué) 金陵學(xué)院，江蘇 南京 210089；2.南京曉莊學(xué)院 環(huán)境科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 211171)

瘦肉精可以減少動(dòng)物脂肪產(chǎn)生，增加肌肉合成，從而增加肉制品的瘦肉率。許多不法商家為了實(shí)現(xiàn)自身經(jīng)濟(jì)利益，使用瘦肉精含量超標(biāo)的飼料飼喂動(dòng)物，導(dǎo)致動(dòng)物性食品中瘦肉精含量超標(biāo)。人類食用瘦肉精含量過高的食物15 min～6 h后即可出現(xiàn)頭暈、惡心、心跳衰弱、手腳顫抖等一系列臨床中毒癥狀，嚴(yán)重者甚至?xí)劳?。因此，瘦肉精在我國畜牧業(yè)產(chǎn)業(yè)中被列為禁用物質(zhì)[1-3]。

瘦肉精種類多樣，其中最常見的是克倫特羅(Clenbuterol，CLEN)和萊克多巴胺(Ractopamine，RAC)。常用的瘦肉精檢測(cè)方法有毛細(xì)管電泳(CE)[4-8]、高效液相色譜法(HPLC)[9-11]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)[12-15]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)[16-22]、膠體金層析法(GICA)[23-30]、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)[31-36]、化學(xué)發(fā)光免疫法(CLIA)[37-44]、免疫芯片法[45-48]等。色譜法作為一種經(jīng)典的方法，具有靈敏度高、準(zhǔn)確性好等特點(diǎn)，但其樣品前處理步驟繁冗復(fù)雜，不但需要昂貴的儀器支持還需要專業(yè)的技術(shù)人員進(jìn)行操作，檢測(cè)時(shí)間長，不能滿足現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的要求，也不利于大批量檢測(cè)。免疫分析法作為一種新的檢測(cè)方法，因具有操作簡(jiǎn)單、特異靈敏、精確、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)而備受矚目。

本文利用重氮化法和丁二酸酐法分別合成了克倫特羅和萊克多巴胺人工抗原，建立了多殘留同時(shí)檢測(cè)的微陣列蛋白芯片法用于豬肝豬肉樣本中克倫特羅和萊克多巴胺殘留的檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及試劑

1.1.1 儀 器電子天平(江蘇省常熟市意歐儀器儀表有限公司)；DMT-2500多管漩渦混合儀(上?？禄磧x器有限公司)；渦旋振蕩器(海門市其林貝爾儀器制造公司產(chǎn)品)；HX-4拍打式均質(zhì)器(上海滬析實(shí)業(yè)有限公司)；微孔板恒溫振蕩儀、洗板機(jī)、芯片分析儀(南京祥中生物科技有限公司)；聚苯乙烯離心管，槍頭(美國Axygen有限公司)；微量移液器(芬蘭百得實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司)。

1.1.2 藥品及試劑碳二亞胺鹽(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、丁二酸酐、牛乳清白蛋白(BSA)(美國Sigma公司)；二甲基亞砜(DMSO)、亞硝酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、無水磷酸氫二鈉、無水磷酸二氫鉀、Tween 20(分析純，南京化學(xué)試劑股份有限公司)；微孔板、克倫特羅和萊克多巴胺抗體、納米銀標(biāo)記的羊抗鼠IgG、顯色液A和B(南京祥中生物科技有限公司)。

1.1.3 主要溶液的配制磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4)：稱取4.003 1 g氯化鈉，0.100 6 g氯化鉀，0.716 8 g無水磷酸氫二鈉，0.122 5 g無水磷酸二氫鉀，溶解并定容至500 mL容量瓶。

0.5 mol/L氫氧化鈉溶液：稱取2.0 g氫氧化鈉加入100 mL去離子水溶解，混勻。

洗滌工作液(PBS+0.05%Tween 20)：1 L PBS+500 μL Tween 20。

1.2 檢測(cè)原理

參照文獻(xiàn)[49-50]進(jìn)行克倫特羅人工抗原(CLEN-BSA)和萊克多巴胺人工抗原(RAC-BSA)的合成。采用間接競(jìng)爭(zhēng)免疫法，將合成的兩種人工抗原點(diǎn)樣后固定于多孔板內(nèi)，加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)品或樣品和相應(yīng)的抗體，固定在孔板底部的人工抗原和溶液中游離的標(biāo)準(zhǔn)品會(huì)與其抗體發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)。隨后加入納米銀標(biāo)記的羊抗鼠IgG與人工抗原上結(jié)合的抗體反應(yīng)，最后加入含有銀離子的還原性顯色液，納米銀催化銀離子還原形成肉眼可見的黑色沉淀后，測(cè)定板底灰度信號(hào)值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中克倫特羅和萊克多巴胺的含量。圖1為檢測(cè)原理示意圖。

圖1 可視化蛋白芯片同時(shí)檢測(cè)克倫特羅和萊克多巴胺的反應(yīng)原理示意圖Fig.1 Schematic diagram of reaction principle of simultaneous detection of clenbuterol and ractopamine by protein chip

1.3 檢測(cè)方法

依次加入50 μL標(biāo)準(zhǔn)品工作液和50 μL相應(yīng)的抗體至各個(gè)蛋白芯片微孔中，以蓋板膜封板，于25 ℃，600 r/min下反應(yīng)30 min，洗板；再在每孔中加入50 μL納米銀標(biāo)記的羊抗鼠IgG，于37 ℃，600 r/min下反應(yīng)30 min，洗板；將顯色A液和顯色B液按1∶1比例混合均勻(現(xiàn)配現(xiàn)用)。每孔加入混合后的溶液50 μL，于37 ℃，600 r/min避光顯色約12 min，洗板；將顯色后的芯片放入芯片分析儀中獲取圖像，啟用默認(rèn)的芯片專用軟件(MiELISA)進(jìn)行自動(dòng)化分析，自動(dòng)生成結(jié)果報(bào)告。

1.4 樣品前處理

稱取(2.0±0.1) g 均質(zhì)后的豬肝或豬肉樣本至50 mL離心管中，加入6 mL三氯乙酸(1%，質(zhì)量分?jǐn)?shù))，渦旋3 min，再在5 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min；取1 mL上清液，用0.5 mol/L NaOH溶液調(diào)至pH值中性，渦旋10 s，于5 000 r/min轉(zhuǎn)速下(豬肉為10 000 r/min)離心 5 min；取50 μL上清液用于檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 克倫特羅與萊克多巴胺人工抗原及抗體濃度的優(yōu)化

在免疫分析中，抗原抗體的濃度會(huì)影響方法的靈敏度?？乖贵w的濃度高，信號(hào)值也高，但方法的靈敏度會(huì)降低。實(shí)驗(yàn)對(duì)抗原抗體的濃度(以稀釋倍數(shù)表示)進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果如表1～2所示。

表1 克倫特羅人工抗原和抗體的濃度優(yōu)化Table 1 Optimization concentration of clenbuterol artificial antigen and antibody

表2 萊克多巴胺人工抗原和抗體的濃度優(yōu)化Table 2 Optimization concentration of ractopamine artificial antigen and antibody

由表1～2中數(shù)據(jù)可知，克倫特羅人工抗原濃度為1∶30，抗體濃度為1∶200 000時(shí)，克倫特羅最高信號(hào)值位于35 000～40 000之間，信號(hào)值適中，靈敏度較高，0.5 ng/g的抑制率為35.27%。萊克多巴胺人工抗原濃度為1∶8，抗體濃度為1∶100 000時(shí)，萊克多巴胺的最高信號(hào)值位于35 000～40 000之間，靈敏度較高，0.5 ng/g的抑制率為17.75%。因此，采用克倫特羅人工抗原濃度為1∶30，抗體濃度為1∶200 000；萊克多巴胺人工抗原濃度為1∶8，抗體濃度為1∶100 000。

表3 克倫特羅和萊克多巴胺的交叉反應(yīng)率Table 3 Cross-reaction rates of clenbuterol and ractopamine

2.2 交叉反應(yīng)率(特異性)

測(cè)定了克倫特羅和萊克多巴胺抗體與其他瘦肉精類藥物之間的交叉反應(yīng)率。以不同濃度的藥物與兩者的抗原、抗體建立競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線，分別求出各自的IC50，并按照公式CR=IC50(被測(cè)藥物)/IC50(干擾物)×100%計(jì)算交叉反應(yīng)率CR，結(jié)果見表3。

由表3可知，克倫特羅和萊克多巴胺的抗體特異性良好，與其他瘦肉精類藥物之間的交叉反應(yīng)率均小于1%?？蓪煞N抗原以微陣列形式固定于同一孔底，進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

根據(jù)優(yōu)化的抗原抗體條件，將克倫特羅抗原以1∶30稀釋后點(diǎn)樣固定于微孔板底部，抗體1∶200 000稀釋，6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品含量分別為0、 0.07、0.15、 0.3、 0.6、1.2 ng/g。萊克多巴胺抗原以1∶8稀釋后點(diǎn)樣固定于微孔板底部，抗體1∶100 000稀釋，6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品含量分別為0、0.05、0.1、0.2、 0.4、0.8 ng/g。用芯片分析軟件提取灰度信號(hào)值，并用濃度對(duì)數(shù)(lgc，x)和抑制率(B/B0，y)作標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，克倫特羅的線性方程為y=-53.286x+14.015，r2=0.987 5；萊克多巴胺的線性方程為y=-53.510x-4.081，r2=0.990 9。

2.4 樣本的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

豬肉、豬肝樣本采購于當(dāng)?shù)爻?，并用質(zhì)譜驗(yàn)證不含克倫特羅和萊克多巴胺。取4種不同的豬肉樣本，每個(gè)樣本各取4份，其中克倫特羅的加標(biāo)水平分別為0、0.5、1、2 ng/g，萊克多巴胺的加標(biāo)水平分別為0、0.2、0.5、1 ng/g。豬肉樣本芯片掃描結(jié)果如圖2所示，檢測(cè)結(jié)果見表4。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品和豬肉樣本檢測(cè)結(jié)果掃描圖Fig.2 Scanning results of standard and pork sample teststandard detection hole was in red frame area,and pork sample detection hole was in yellow frame area;sample sequence was from top to bottom,from left to right,and each sample repeated 2 holes;nano silver-labeled goat anti-mouse IgG was used as quality control in each well(紅色框內(nèi)為標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)孔，黃色框內(nèi)為豬肉樣本檢測(cè)孔；加樣順序從上往下，從左往右，每個(gè)樣重復(fù)2個(gè)孔;每個(gè)孔內(nèi)均設(shè)有質(zhì)控，為納米銀標(biāo)記的羊抗鼠IgG)

(續(xù)表4)

CompoundPorksampleAdded(ng·g-1)Found(ng·g-1)Recovery(%)RSD(%)400.172.10.50.831323.611.181017.222.07958.2Ractopamine100.025.30.20.231058.20.50.551076.610.94923.4200.005.20.20.17837.60.50.511026.510.85858.9300.007.60.20.19957.30.50.43864.810.77775.3400.013.20.20.211036.70.50.49963.310.98984.7

由表4可知豬肉樣本中克倫特羅的加標(biāo)回收率為75%～132%，萊克多巴胺的加標(biāo)回收率為77%～107%，兩者的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差都小于10%(n=3)，符合檢測(cè)要求。

用同樣方法對(duì)豬肝樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明豬肝樣本中克倫特羅的加標(biāo)回收率為74%～106%，萊克多巴胺的加標(biāo)回收率為87%～125%，檢測(cè)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差都小于10%(n=3)，符合檢測(cè)要求。

2.5 實(shí)際樣本的檢測(cè)

應(yīng)用本方法對(duì)市售的90個(gè)豬肉和豬肝樣本進(jìn)行了檢測(cè)，檢出3個(gè)克倫特羅陽性，其值分別為0.32、0.26、0.41 ng/g，均低于農(nóng)業(yè)部規(guī)定的最高殘留限量(0.50 ng/g)；檢出2個(gè)萊克多巴胺陽性，其值分別為0.36、0.44 ng/g，均低于農(nóng)業(yè)部規(guī)定的最高殘留限量(0.50 ng/g)。同時(shí)將5個(gè)陽性樣品使用HPLC-MS方法進(jìn)行檢測(cè)，其中，克倫特羅HPLC-MS的檢出值分別為 0.29、 0.22、 0.36 ng/g；萊克多巴胺分別為0.31、0.41 ng/g。與本方法的結(jié)果基本一致。

3 結(jié) 論

本文建立了多殘留同時(shí)檢測(cè)的可視化微陣列蛋白芯片法，并用于克倫特羅和萊克多巴胺的檢測(cè)。該方法具有通量大，操作簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確性好和精密度高等優(yōu)點(diǎn)，可用于實(shí)際樣品中上述兩者殘留含量的測(cè)定。