超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜快速篩查染發(fā)劑中32種染料成分

鞠玲燕,李兆杰*,宋衛(wèi)得,徐成鋼,崔 嘉

(1.威海海關(guān)，山東 威海 264205；2.日照海關(guān)，山東 日照 276800)

氧化型染發(fā)劑因效果好且顏色持久被廣泛應(yīng)用，但這類染發(fā)劑含有芳香胺類和酚類染料成分，這些組分長期使用具有不同程度的致癌、致畸和致敏性[1-3]。鑒于氧化型染發(fā)劑的安全性問題，我國《化妝品安全技術(shù)規(guī)范(2015年版)》明確規(guī)定了染發(fā)劑中禁限用染料組分的類別及其使用限量，并發(fā)布了高效液相色譜法用于分析對苯二胺等32種染料，加強染發(fā)劑中染料成分安全性的監(jiān)測。文獻中也建立了其他檢測方法，但是這些方法存在一些不足，如采用液相色譜法[4-9]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[10]所覆蓋的染料種類有限，涉及多種染料成分時往往需多個檢測系統(tǒng)，且對復(fù)雜基質(zhì)的抗干擾能力不足；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[11-15]雖具有分離度高、特異性強等優(yōu)點，但因其反應(yīng)模式的限制，無法同時在正負(fù)離子模式下檢測，檢測時需建立正負(fù)兩個檢測系統(tǒng)，且質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化過程比較繁瑣。本研究克服以上方法的不足，以苯二胺等32種禁限用染料為對象，建立了超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法同時測定染發(fā)劑中多種染料成分的快速篩查和定量分析方法。本方法通過正負(fù)離子同時掃描模式，僅需一個系統(tǒng)即可實現(xiàn)32種染料組分的有效分離，18 min內(nèi)完成檢測；直接采用一級母離子精確質(zhì)量數(shù)獲得定性和定量結(jié)果，且無需優(yōu)化碰撞能，質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化過程也大大簡化；利用梯度碰撞能自動觸發(fā)獲得的豐富的二級碎片離子對定性結(jié)果進行確證，避免了假陽性出現(xiàn)的幾率，提高了定性的準(zhǔn)確性。該方法方便、快捷、高通量、靈敏度高、特異性好，可同時對染發(fā)劑中多種染料成分進行測定，保證染發(fā)劑質(zhì)量安全。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀Q-Exactive(美國ThermoFisher公司)；CR22GⅡ高速冷凍離心機(日立公司)。

32種染料成分標(biāo)準(zhǔn)品純度均>95%;間苯二酚、甲苯-2，5-二胺硫酸鹽、對苯二胺、對氨基苯酚、間氨基苯酚、4-氯間苯二酚、鄰苯二胺、鄰氨基苯酚、2-硝基對苯二胺、甲苯-3，4-二胺、N，N-二乙基甲苯-2，5-二胺鹽酸鹽、對苯二酚、2，6-二氨基吡啶、N，N-二乙基對苯二胺硫酸鹽、1-萘酚購自德國Dr.Ehrenstorfer公司；2-氨基-3-羥基吡啶、4-氨基-2-羥基甲苯、2，4-二氨基苯氧基乙醇鹽酸鹽、N，N-雙(2-羥乙基)對苯二胺硫酸鹽、2-氯對苯二胺硫酸鹽、苯基甲基吡唑啉酮、4-氨基-3-硝基苯酚、4-硝基鄰苯二胺、對甲基氨基苯酚硫酸鹽、6-羥基吲哚、N-苯基對苯二胺、2，7-萘二酚、1，5-萘二酚購自上海安譜公司；2-甲基間苯二酚、6-氨基間甲酚、4-氨基間甲酚購自德國CNW公司；間苯二胺購自美國Accustandard公司。甲醇(色譜純，美國默克公司)；正己烷、乙酸銨(色譜純，德國CNW公司)；抗壞血酸(分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)。

標(biāo)準(zhǔn)儲備液：甲苯-2，5-二胺硫酸鹽和2-氯對苯二胺硫酸鹽采用2 g/L抗壞血酸水溶液配制；2-硝基對苯二胺、甲苯-3，4-二胺采用甲醇配制，其余染料均采用甲醇-2 g/L抗壞血酸水溶液(體積比50∶50)配制；標(biāo)準(zhǔn)工作液采用甲醇-2 g/L抗壞血酸水溶液(體積比50∶50)配制，儲存于4 ℃冰箱于2 d內(nèi)使用。

1.2 色譜-質(zhì)譜條件

1.2.1 色譜條件色譜柱：Eclipse Plus C18(3.0 mm×100 mm，1.8 μm)；流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣體積：5 μL；流動相：A為甲醇，B為5 mmol/L的乙酸銨水溶液。梯度洗脫程序：0～1 min，10% A；1～6 min，10%～50% A；6～12 min，50%～80% A；12～14 min，80% A；14～15 min，80%～10% A；16～18 min，10% A；總分析時間：18 min。

1.2.2 質(zhì)譜條件噴霧電壓：正離子模式3.5 kV，負(fù)離子模式3.0 kV；離子源溫度：350 ℃；金屬毛細管溫度：320 ℃；鞘氣壓力：35 arb；輔助氣壓力：15 arb；掃描范圍(m/z)：50～750 Da；一級質(zhì)譜全掃描(Full scan)分辨率：R=70 000；AGC target：3e6；最大注入時間：100 ms；數(shù)據(jù)依賴二級離子全掃描(Full MS/ddMS2)分辨率：R=17 500；歸一化碰撞能：20、45、70 eV；AGC target：e5；最大注入時間：50 ms；動態(tài)排除：10 s。32種染料的質(zhì)譜信息見表1。

1.3 樣品前處理

氧化型染發(fā)劑一般包括染發(fā)組分(1劑或A劑)和顯色組分(2劑和B劑)兩劑，檢測時準(zhǔn)確稱取1劑或A劑染發(fā)劑、染發(fā)霜或染發(fā)焗油等染發(fā)組分0.25 g(精確至0.000 1 g)至50 mL離心管中，加入25 mL甲醇-2 g/L抗壞血酸水溶液(體積比50∶50)，渦旋1 min，超聲提取15 min，取3 mL提取液，加入3 mL正己烷，渦旋1 min，以8 000 r/min離心5 min，移取下層清液過0.22 μm微孔濾膜，上機檢測。根據(jù)樣品中染料含量，檢測時可取處理后的樣品溶液適當(dāng)稀釋至所需的質(zhì)量濃度。

表1 32種染料組分的CAS號、分子式、離子類型、保留時間和精確質(zhì)量數(shù)Table 1 CAS no.,molecular formula,ion formation,retention time and theoretical accurate mass of the 32 dyes

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理

2.1.1 提取溶劑的選擇由于氧化型染發(fā)劑中很多染料組分易氧化，因此在配制標(biāo)準(zhǔn)溶液和提取過程中加入抗壞血酸來提高其穩(wěn)定性；另外，因染料性質(zhì)不同，一些染料成分在極性溶劑中具有較好的溶解性，而個別染料成分(如甲苯-2，5-二胺硫酸鹽和2-氯對苯二胺硫酸鹽等)在水中具有較好的溶解性。因此，實驗考察了甲醇-2 g/L抗壞血酸水溶液(50∶50)、乙腈-2 g/L抗壞血酸水溶液(50∶50)和乙醇-2 g/L抗壞血酸水溶液(50∶50)為提取試劑時待測物的提取效率和提取體系的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，以乙腈-2 g/L抗壞血酸水溶液提取時，甲苯-2，5-二胺硫酸鹽、2，4-二氨基苯氧基乙醇鹽酸鹽、N，N-雙(2-羥乙基)對苯二胺硫酸鹽均出現(xiàn)了溶劑效應(yīng)；以乙醇-2 g/L抗壞血酸水溶液提取時，甲苯-2，5-二胺硫酸鹽、2，4-二氨基苯氧基乙醇鹽酸鹽、N，N-雙(2-羥乙基)對苯二胺硫酸鹽和2-氨基-3羥基吡啶峰形不佳，溶劑效應(yīng)嚴(yán)重；而采甲醇-2 g/L抗壞血酸水溶液提取時32種染料的色譜峰形均較好(圖1)，不存在嚴(yán)重的溶劑效應(yīng)，完全滿足實驗要求。因此，實驗采用甲醇-2 g/L抗壞血酸水溶液(50∶50)為提取溶劑。

圖1 32種染料組分的提取離子色譜圖Fig.1 Extracted ion chromatograms of the 32 dyes the peak 1-32 were as same as those in Table 1

2.1.2 凈化溶劑的選擇氧化型染發(fā)劑在配方中會添加較多油脂類物質(zhì)，直接采用極性溶劑超聲的樣品前處理方法，較難去除樣品中的油脂類物質(zhì)，還會降低色譜柱的使用壽命及質(zhì)譜響應(yīng)。因此，本實驗利用常見弱極性溶劑正己烷除去樣品基質(zhì)中的油脂類物質(zhì)，以達到凈化樣品的目的。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

實驗考察了Eclipse Plus C18(3.0 mm×100 mm，1.8 μm)超高效色譜柱和普通的C18色譜柱對待測物的分析效果。結(jié)果顯示，與傳統(tǒng)液相色譜法相比，超高效色譜柱對各待測物分離效果好，可在較短的時間內(nèi)實現(xiàn)32種染料成分中7對同分異構(gòu)體(間苯二酚和對苯二酚；甲苯-3，4-甲苯-2，5-二胺硫酸鹽和甲苯3，4-二胺；對苯二胺、間苯二胺和鄰苯二胺；對氨基苯酚、間氨基苯酚和鄰苯二胺；4-氨基間甲酚、對甲基氨基苯酚硫酸鹽、4氨基-2-羥基甲苯和6氨基間甲酚；2-硝基對苯二胺和4-硝基鄰苯二胺；2，7-萘二酚和1，5-萘二酚)的良好分離，顯著提高了同分異構(gòu)體目標(biāo)物定性和定量分析的準(zhǔn)確性。另外，不同流動相對分析結(jié)果的影響顯示，有機相采用甲醇的分離效果和信號強度優(yōu)于乙腈，且當(dāng)流動相中加入5 mmol/L乙酸銨后，可兼顧正負(fù)離子模式的各種染料組分的信號強度，故采用甲醇-5 mmol/L的乙酸銨作為流動相。優(yōu)化后的色譜條件見“1.2.1”所述，各染料組分在18 min內(nèi)獲得較好的分離效果和較理想的峰形。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

本研究采用高分辨質(zhì)譜的一級質(zhì)譜全掃描加數(shù)據(jù)依賴的二級質(zhì)譜掃描方式，對目標(biāo)檢測物進行定性篩查和確證。為了兼顧所有待測物，采用正負(fù)離子切換方式同時進行分析，檢測時無需采用多個檢測系統(tǒng)多次檢測，縮短了檢測時間。在正負(fù)離子模式下分別提取32種染料組分的一級母離子精確質(zhì)量數(shù)，發(fā)現(xiàn)間苯二酚、4-氯間苯二酚、2-甲基間苯二酚、4-氨基-3-硝基苯酚、對苯二酚、2，7-萘二酚、1，5-萘二酚、1-萘酚8種染料組分在負(fù)離子模式下響應(yīng)強度高，離子干擾少，其母離子均為[M-H]-；而其他染料組分在正離子模式下響應(yīng)強度高。在正離子模式的染料組分中，甲苯-2，5-二胺硫酸鹽、N，N-雙(2-羥乙基)對苯二胺硫酸鹽、2-氯對苯二胺硫酸鹽、對甲基氨基苯酚硫酸鹽和N，N-二乙基對苯二胺硫酸鹽的母離子均為[M-H2SO4+H]+；2，4-二氨基苯氧基乙醇鹽酸鹽母離子為[M-2HCl+H]+；N，N-二乙基甲苯-2，5-二胺鹽酸鹽的母離子為[M-HCl+H]+，其余均為[M+H]+。通過正負(fù)離子切換全掃描模式確定目標(biāo)物離子類型、母離子的精確質(zhì)量數(shù)和保留時間(見表1)。使用高分辨質(zhì)譜檢測目標(biāo)化合物的精確質(zhì)量數(shù)對于同時準(zhǔn)確定性和定量非常重要，因此必須保證質(zhì)譜數(shù)據(jù)具有良好的質(zhì)量準(zhǔn)確度。表2列出的32種目標(biāo)物的母離子質(zhì)量準(zhǔn)確度誤差均小于10 ppm，可見檢測物的質(zhì)量準(zhǔn)確度均很好，可滿足定性定量需求。

通過全掃描獲得目標(biāo)化合物母離子精確質(zhì)量數(shù)，根據(jù)獲得的精確質(zhì)量數(shù)設(shè)定目標(biāo)物列表，僅在一級質(zhì)譜掃描時發(fā)現(xiàn)列表中的母離子，且其強度達到設(shè)定閥值時，即自動進行二級質(zhì)譜掃描。設(shè)定高、中、低3個碰撞能量(20、45、70 eV)對目標(biāo)物進行碰撞，最終加和獲得豐富的二級碎片離子(見表2)。分析結(jié)果既有母離子的精確質(zhì)量數(shù)，又有二級碎片離子信息，提高了定性的準(zhǔn)確性，顯著降低了假陽性出現(xiàn)的幾率。此外，高分辨質(zhì)譜以母離子作為定量離子，且直接采用梯度設(shè)置碰撞能，簡化了質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化，節(jié)省了樣品分析前的準(zhǔn)備時間，更利于樣品的快速篩查和定量分析。

表2 32種染料組分的質(zhì)量準(zhǔn)確度誤差和碎片離子Table 2 Mass accuracy error and fragment ions of the 32 dyes

(續(xù)表2)

No.CompoundTheoreticalaccuratemass(m/z)Measuredaccuratemass(m/z)Massaccuracyerror(ppm)Fragmentions(m/z)132-Aminophenol110.06004110.060070.2792.04948,83.04914142-Nitro-1,4-phenylenediaine154.06110154.06099-0.71119.04780,108.06820153,4-Diaminotoluene123.09167123.091901.87106.06513,79.05423162-Methylresorcinol123.04515123.04476-3.1795.01385,79.05532176-Amino-m-cresol124.07569124.075871.45106.06513,79.0542318Edaravone175.08659175.08614-2.57133.07602,106.06513194-N,N-Diethyl-2-methyl-p-phenylenediaminemonohydrochloride179.15428179.15398-1.67151.12298,136.09950204-Amino-3-nitrophenol153.03057153.02934-8.04122.02475,78.0349221m-Phenylenediamine109.07602109.076141.1093.04472,80.0494822Hydroquinone109.02950109.02891-5.4165.03967,67.01894234-Amino-m-cresol124.07569124.075871.45109.05222,79.05423244-Methylaminophenolsulfate124.07569124.075891.61109.05222,80.04948254-Nitro-o-phenylenediamine154.06110154.06100-0.65137.05836,108.06820262,6-Diaminopyridine110.07127110.071300.2793.04472,66.0338327N,N-Diethyl-p-phenylenediaminesulfate165.13863165.13817-2.79136.09950,121.07602286-Hydroxyindole134.06004134.05975-2.16107.04914,92.04948292,7-Dihydroxynaphthalene159.04515159.04442-4.59115.05532,131.05024304-Aminodiphenylamine185.10732185.107450.7093.05840,108.08187311,5-Dihydroxynaphthalene159.04515159.04445-4.40130.04241,103.05532321-Naphthol143.05024143.04951-5.10115.05532,79.01894

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1 線性范圍與檢出限用甲醇-2 g/L抗壞血酸水溶液(50∶50)配制32種染料的混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，在優(yōu)化條件下測定，以染料的色譜峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，對應(yīng)質(zhì)量濃度(X，μg/L)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用向空白樣品中逐級降低加標(biāo)濃度至儀器能夠定量檢出的最低加標(biāo)濃度為方法定量下限(LOQ)。結(jié)果表明，32種染料組分在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r2)不低于0.997 2，LOQ為0.2～40 μg/g，可滿足檢測要求(表3)。該方法較《化妝品安全技術(shù)規(guī)范(2015年)》中收錄的液相色譜法靈敏度和特異性更好，能對染發(fā)劑中的染料成分進行更好的監(jiān)測。

表3 32種染料組分的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、定量下限、平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD,n=6)Table 3 Linear ranges,correlation coefficients,LOQs,average recoveries and the relative standard deviations(n=6) of the 32 dyes

(續(xù)表3)

No.CompoundLinearrange(μg/L)r2LOQ(μg/g)Spiked(μg/g)Averagerecovery(%)RSD(%)204-Amino-3-nitrophenol100～40000.99801010,50,10099.6,94.0,98.36.9,7.5,5.221m-Phenylenediamine4～10000.99930.40.4,2.0,4.089.1,90.3,95.59.2,8.7,7.822Hydroquinone400～40000.99954040,200,400108,99.4,1059.6,7.6,8.8234-Amino-m-cresol10～10000.99991.01.0,5.0,1093.1,88.3,95.97.8,9.2,6.5244-Methylaminophenolsulfate2～4000.99970.20.2,1.0,2.085.4,89.5,90.49.3,9.1,7.8254-Nitro-o-phenylenediamine40～20000.99734.04.0,20,4092.5,97.4,1008.2,7.4,5.2262,6-Diaminopyridine2～4000.99860.20.2,1.0,2.088.4,96.9,1029.9,8.0,8.127N,N-Diethyl-p-phenylenediaminesulfate4～10000.99930.40.4,2.0,4.098.6,108,99.37.3,7.9,6.0286-Hydroxyindole100～40000.99811010,50,10099.2,104,99.07.1,6.5,5.3292,7-Dihydroxynaphthalene40～20000.99814.04.0,20,40105,101,1088.9,7.5,4.8304-Aminodiphenylamine2～4000.99880.20.2,1.0,2.093.1,88.3,95.99.0,9.5,7.0311,5-Dihydroxynaphthalene10～10000.99721.01.0,5.0,1089.4,99.9,96.09.8,9.0,5.8321-Naphthol40～20000.99964.04.0,20,4098.9,99.4,1068.8,7.0,5.1

content of dye components in hair dyes(μg/g)=mass concentration of components to be measured from standard curve(μg/L)*dilution multiple/1 000(染發(fā)劑中染料組分的含量(μg/g)=從標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到的待測組分的質(zhì)量濃度(μg/L)*稀釋倍數(shù)/1 000)

2.4.2 回收率及精密度由于氧化型染發(fā)劑中均含有幾種染料成分，因此很難獲得針對32種染料成分的空白樣品，因此進行方法學(xué)驗證時，首先對市售染發(fā)劑進行了32種成分的檢測，選出2種染發(fā)劑作為空白樣品，一種染發(fā)劑除含有2-氨基-3-羥基吡啶和2，4-二氨基苯氧基乙醇鹽酸鹽外不包含其余30種染料成分(6#樣品)，采用該染發(fā)劑對不含有的30種染料組分進行方法學(xué)驗證；同時選擇不含有2-氨基-3-羥基吡啶和2，4-二氨基苯氧基乙醇鹽酸鹽的另一種染發(fā)劑(5#樣品)，對這2種組分進行方法學(xué)驗證。選取上述染發(fā)劑空白樣品，分別添加低、中、高3個濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“1.3”方法進行前處理，每個水平重復(fù)測定6次，計算其回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見表3。32個染料的平均回收率為81.0%～110%，RSD為3.3%～9.9%，表明方法具有較好的回收率和重復(fù)性。

2.5 實際樣品的檢測

對8種市售染發(fā)劑在優(yōu)化條件下采用本方法測定，共檢出10種染料成分(表4)，檢出含量均小于《化妝品安全技術(shù)規(guī)范(2015年版)》中的限量要求，與樣品標(biāo)示的染料組分相同。8種染發(fā)劑中除6#染發(fā)劑以外，其余均含有間苯二酚、對苯二胺和甲苯-2，5-二胺硫酸鹽等多種致癌或致敏性強的染料組分。6#染發(fā)劑中2-氨基-3-羥基吡啶和2，4-二氨基苯氧基乙醇鹽酸鹽的色譜圖和二級質(zhì)譜圖見圖2。

表4 8種染發(fā)劑中染料成分的測定結(jié)果Table 4 Analytical results of 32 dyes in 8 oxidative hair dyes

3 結(jié) 論

本研究建立了超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜快速定性篩查和定量分析染發(fā)劑中32種染料成分的方法。該方法簡單、快速、靈敏，無需繁瑣的質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化過程，采用正負(fù)離子模式同時掃描，僅一次檢測即可同時分析32種染料組分，并能準(zhǔn)確定性定量，適用于染發(fā)劑中染料的快速篩查測定，有助于染發(fā)劑質(zhì)量安全監(jiān)管。

圖2 6#染發(fā)劑中2-氨基-3-羥基吡啶和2，4-二氨基苯氧基乙醇鹽酸鹽的色譜圖和二級質(zhì)譜圖Fig.2 Chromotography and two-stage full mass scan spectrum of 5-amino-o-cresol and 2，4-diaminophenoxyethanol dihydrochloride in 6# dyesA.chromotography of 5-amino-o-cresol;B.two-stage full mass scan spectrum of 5-amino-o-cresol;C.chromotography of 2，4-diamino-phenoxyethanol dihydrochloride;D.two-stage full mass scan spectrum of 2，4-diaminophenoxyethanol dihydrochloride