高效液相色譜法測定脂肪中11種苯并咪唑類藥物殘留標(biāo)志物

邵琳智，鄒 游，陳思敏

(廣東檢驗檢疫技術(shù)中心，廣東 廣州 510623)

苯并咪唑類(Benzimidazoles，BMZs)藥物由于特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)而具有良好的生物活性[1]，是一種廣譜、高效的驅(qū)蟲藥，廣泛用于治療豬、牛、羊消化道寄生蟲病[2]。作為寄生蠕蟲疾病治療的首選藥物，苯并咪唑類藥物發(fā)展非常迅速[3]，隨之也帶來了許多潛在風(fēng)險。研究表明，苯并咪唑類藥物具有致畸與致突變作用，其亞砜化物、羥化產(chǎn)物等代謝物具有胚胎毒性[4]，因此許多國家將該類藥物及其代謝物同時列為牛、羊、豬的肌肉、脂肪、肝、腎以及禽肉、禽蛋和奶中的限用物質(zhì)進(jìn)行監(jiān)控。

我國最新制定的食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)《動物性食品中獸藥最大殘留限量》(征求意見稿)[5]對農(nóng)業(yè)部

235號公告[6]進(jìn)行修訂，其中苯并咪唑類藥物增至9種，對其殘留標(biāo)志物亦作了較大修改。規(guī)定非班太爾、芬苯達(dá)唑、奧芬達(dá)唑的殘留標(biāo)志物為芬苯達(dá)唑、奧芬達(dá)唑和奧芬達(dá)唑-2-氨基砜的總和；奧苯達(dá)唑的殘留標(biāo)志物為奧苯達(dá)唑；噻苯達(dá)唑的殘留標(biāo)志物為噻苯達(dá)唑和5-羥基噻苯達(dá)唑；三氯苯達(dá)唑的殘留標(biāo)志物為三氯苯達(dá)唑酮；阿苯達(dá)唑的殘留標(biāo)志物為阿苯達(dá)唑-2-氨基砜；氟苯達(dá)唑的殘留標(biāo)志物為氟苯達(dá)唑；甲苯達(dá)唑的殘留標(biāo)志物為2-氨基-5-苯甲?；讲⑦溥蚝?-羥基甲苯達(dá)唑。修改后的殘留標(biāo)志物增至11種，與食品法典委員會(CAC)和歐盟的苯并咪唑類藥物最大殘留限量要求基本一致。

該征求意見稿[5]規(guī)定阿苯噠唑的殘留標(biāo)志物在脂肪中的最高殘留限量(MRL)為100 μg/kg；非班太爾、芬苯噠唑、奧芬噠唑的殘留標(biāo)志物在牛、羊、豬、馬脂肪中的MRL為100 μg/kg，家禽中為50 μg/kg(僅芬苯噠唑)；奧苯噠唑的殘留標(biāo)志物在豬脂肪中MRL為500 μg/kg；噻苯噠唑的殘留標(biāo)志物在牛、豬、羊脂肪中的MRL為100 μg/kg；三氯苯噠唑的殘留標(biāo)志物在牛、羊脂肪中的MRL為100 μg/kg。但相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)[7-8]、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[9]和文獻(xiàn)報道[2,10-16]中，主要是針對肌肉、肝、腎等動物組織或禽肉、蛋和奶中的苯并咪唑類藥物及代謝物檢測，極少涉及脂肪基質(zhì)。由于脂肪的油脂含量大，包裹性和黏附性強(qiáng)[17]，導(dǎo)致提取非常困難，凈化效果不佳。此外，脂肪含有較多飽和脂肪酸，氧化能力較強(qiáng)，而苯并咪唑類藥物不穩(wěn)定，前處理過程易發(fā)生降解，尤其是5-羥基噻苯達(dá)唑；若采用國標(biāo)的凈化流程，三氯苯達(dá)唑酮等殘留標(biāo)志物幾乎不保留，加標(biāo)回收率極低。本文采用更具廣泛適用性的前處理方式，尤其是對易降解殘留化合物的保護(hù)技術(shù)，并以極性大、穿透力強(qiáng)的乙腈作為提取溶劑，可有效減少脂溶性雜質(zhì)的共提取[18]，從而建立了同時測定雞、豬脂肪中上述11種苯并咪唑類藥物殘留標(biāo)志物的高效液相色譜(HPLC)法，填補了脂肪中同時檢測苯并咪唑類藥物殘留標(biāo)志物的技術(shù)空白。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

LC-20AD高效液相色譜儀，配自動進(jìn)樣器、柱溫箱、紫外檢測器(島津公司)；感量0.000 01 g的分析天平和感量0.01 g的天平(Sartorius公司)；GM 200型肉類組織搗碎機(jī)(Retsch公司)；MS 3 basic旋渦振蕩器、減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(IKA公司)；SW 30H超聲波水浴(Sono Swiss公司)；3-30K離心機(jī)(Sigma公司)。

奧芬達(dá)唑、芬苯達(dá)唑、奧芬達(dá)唑-2-氨基砜、阿苯達(dá)唑-2-氨基砜、噻苯達(dá)唑、5-羥基噻苯達(dá)唑、2-氨基-5-苯甲酰基苯并咪唑、5-羥基甲苯達(dá)唑、氟苯達(dá)唑、奧苯達(dá)唑和三氯苯達(dá)唑酮，純度均在97%以上(德國Dr.Ehrenstorfer公司)，各標(biāo)準(zhǔn)品先用10 mL N,N-二甲基甲酰胺溶解，再用甲醇配成200 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，使用時根據(jù)需要稀釋成混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。沒食子酸丙酯(PG)；乙腈、甲醇(HPLC級，F(xiàn)isher公司)，乙酸(色譜純，Merck公司)；其它未特殊說明的試劑均為分析純；Oasis MCX固相萃取柱(60 mg/3 mL，Waters公司)。豬脂肪和雞脂肪均為送檢樣品。

1.2 實驗方法

提?。悍Q取2 g試樣(準(zhǔn)確至0.01 g)于50 mL離心管中，加入5 mL正己烷，渦旋振蕩5 min，充分溶解脂肪，加入 10 mL 0.1 mol/L鹽酸-乙腈(1∶1，體積比)和0.1 mL 20%PG甲醇溶液，渦旋2 min，置超聲波水浴中超聲5 min，渦旋振蕩15 min，4 000 r/min 離心 5 min，取下層清液5 mL于15 mL離心管中，待凈化。

凈化：向待凈化液中加入2.5 mL 0.1 mol/L鹽酸，混勻后加入3 mL 正己烷，渦旋振蕩2 min，10 000 r/min離心5 min，棄去上層正己烷，下層清液加入20%PG甲醇溶液0.1 mL，混勻，轉(zhuǎn)入經(jīng)預(yù)處理的MCX固相萃取柱中，以小于1 mL/min的流速使樣品溶液全部過柱，棄去流出液。依次用3 mL 0.1 mol/L鹽酸-甲醇(2∶1，體積比)、4 mL 5%氨水溶液淋洗，淋洗液全部過柱，棄去淋洗液，最后用4 mL 5%氨水甲醇洗脫。

濃縮：洗脫液以0.5 mL/min流速全部通過小柱，并收集于帶刻度的濃縮瓶中，38 ℃水浴下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約500 μL后，以0.1 mol/L鹽酸定容至1 mL，渦旋2 min，溶液以10 000 r/min 離心5 min后，供測定。

1.3 液相色譜分析條件

Atlantis T3 色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫：40 ℃；檢測波長：292 nm；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：40 μL；流動相：A為甲醇，B為1%乙酸；梯度洗脫程序:0～10.0 min，10%～45%A；10.0～15.0 min，45%～40%A；15.0～25.0 min，40%～75%A；25.0～35.0 min，75%～90%A；35.0～35.1 min，90%～100%A；35.1～45.0 min，100%A；45.0～45.1 min，100%～10%A；45.1～60.0 min，10%A。

2 結(jié)果與討論

2.1 抗氧化劑的優(yōu)化

2.1.1 抗氧化劑種類的選擇脂肪中富含氧化能力強(qiáng)的飽和脂肪酸，對待測化合物尤其是5-羥基噻苯達(dá)唑有明顯的降解破壞作用，前處理過程若不加抗氧化劑，將導(dǎo)致其回收率極低甚至色譜峰完全消失。林海丹等[11]的研究顯示，1 g/100 mL二丁基羥基甲苯(BHT)可明顯提高奧芬達(dá)唑、奧芬達(dá)唑砜等的提取效率。本實驗比較了GB/T 21324-2007[7]中采用的BHT以及丁基羥基茴香醚(BHA)、特丁基對苯二酚(TBHQ)和PG的抗氧化效果。結(jié)果表明，BHA和TBHQ的抗氧化效果不佳，且待測化合物的色譜圖中雜峰較多；BHT的抗氧化效果差，且由于其水溶性較差，在洗脫液旋蒸時易析出，導(dǎo)致液相色譜系統(tǒng)堵塞，此外BHT對三氯苯達(dá)唑酮有輕微降解作用，使其回收率在70%以下。而PG的抗氧化效果良好，干擾物與待測化合物的色譜峰可基本分離，且PG的水溶性較好，上機(jī)溶液澄清，對三氯苯達(dá)唑酮也有保護(hù)作用，可將其回收率提高15%～20%。本方法最終選擇PG作為抗氧化劑。

2.1.2 抗氧化劑濃度的選擇本實驗采用甲醇溶解PG，比較了PG含量為5%、10%和20%時的抗氧化效果。結(jié)果顯示，5%PG甲醇溶液對雞、豬脂肪中5-羥基噻苯達(dá)唑的保護(hù)力度不夠，其回收率不足50%。對于雞脂肪，10%PG甲醇溶液即能很好地保護(hù)5-羥基噻苯達(dá)唑；但對于豬脂肪，則需20%PG甲醇溶液才能保護(hù)5-羥基噻苯達(dá)唑。本方法最終選擇20%PG甲醇溶液作為抗氧化劑。

2.1.3 抗氧化劑加入次數(shù)的選擇對于豬脂肪，若僅在提取或過柱前加1次20%PG甲醇溶液，5-羥基噻苯達(dá)唑的回收率低于80%，而在提取和過柱前加入2次抗氧化劑才能確保5-羥基噻苯達(dá)唑不被氧化。本方法最終選擇分2次加入20%PG甲醇溶液。

2.2 凈化方式的優(yōu)化

采用MCX固相萃取柱進(jìn)行凈化，按照GB/T 21324-2007[7]的過柱條件處理加標(biāo)樣品時，發(fā)現(xiàn)0.1 mol/L鹽酸淋洗液的除雜效果不佳，且三氯苯達(dá)唑酮會被洗脫下來，導(dǎo)致其回收率為零；以10%氨水乙腈為洗脫液時，則后續(xù)濃縮時間過長，且會影響2-氨基-5-苯甲酰基苯并咪唑的回收率。本方法改用0.1 mol/L鹽酸-甲醇(2∶1)為淋洗液，可除去大部分雜質(zhì)且三氯苯達(dá)唑酮不會被洗脫下來,再配合使用5%氨水溶液淋洗，能有效去除奧芬達(dá)唑-2-氨基砜和5-羥基噻苯達(dá)唑兩峰之間的雜質(zhì)；以5%氨水甲醇為洗脫液對各組分的洗脫比較穩(wěn)定，方法重現(xiàn)性較好，后續(xù)濃縮方便快捷。

2.3 方法學(xué)驗證

2.3.1 線性關(guān)系與定量下限在雞脂肪和豬脂肪空白樣品中，分別添加10.0 mg/L的待測物標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照本方法進(jìn)行測定，以信噪比(S/N)≥10,且回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均符合殘留檢測方法要求時的濃度為定量下限(LOQ)。采用本方法對質(zhì)量濃度為25.0、50.0、100、200、500、1 000 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測定，以待測物的峰面積(Y)對其質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。結(jié)果表明，11種待測物均在25.0～1 000 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.999 8，LOQ均為50 μg/kg，能夠滿足相關(guān)監(jiān)管部門的要求。

2.3.2 準(zhǔn)確度與精密度準(zhǔn)確稱取2.0 g空白雞脂肪和豬脂肪試樣于50 mL離心管中，加入標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，制成3個濃度水平的加標(biāo)樣品，每個濃度做6個平行，按本方法處理后進(jìn)行測定。結(jié)果表明，11種待測物的加標(biāo)回收率為82.0%～109%，RSD為0.71%～9.9%(見表1)。

表1 脂肪樣品中11種目標(biāo)分析物的加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 1 Recoveries and relative standard deviations of 11 analytes in fat samples(n=6)

圖1 豬脂肪空白加標(biāo)樣品的色譜圖(100 μg/L)Fig.1 Chromatogram of spiked pig fat sample(100 μg/L)1.albendazole-2-aminosulfone;2.5-hydroxythiabendazole;3.thiabendazole;4.mebendazole-amine;5.5-hydroxy-mebendazole;6.oxibendazole;7.oxfendazole;8.oxfendazole sulphone;9.flubendazole;10.fenbendazole;11.ketotriclabendazole

2.4 實際樣品測定

采用本方法檢測了廣州市售的雞脂肪和豬脂肪樣品各30份，均未檢出以上11種苯并咪唑類藥物殘留標(biāo)志物，豬脂肪空白加標(biāo)樣品的色譜圖見圖1。本實驗室對豬、雞的肌肉、肝臟、腎臟的日常檢測顯示，11種苯并咪唑類藥物殘留標(biāo)志物的檢出率極低，說明養(yǎng)殖行業(yè)對該類藥物的使用較為規(guī)范。

3 結(jié) 論

本文對抗氧化劑和凈化方式進(jìn)行了優(yōu)化，建立了同時測定雞脂肪和豬脂肪中11種苯并咪唑類藥物殘留標(biāo)志物的高效液相色譜法。雖然本方法的靈敏度與選擇性會明顯低于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，但液相色譜儀在基層實驗室較為普及，因此適用性更廣泛。本方法的定量下限為50 μg/kg，回收率為82.0%～109%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.71%～9.9%，方法定量準(zhǔn)確、抗干擾能力強(qiáng)、重現(xiàn)性好，能夠滿足我國相關(guān)監(jiān)管部門的最新技術(shù)要求。