超臨界二氧化碳萃取結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定毛發(fā)中11種常見(jiàn)精神藥物

徐代化，歐 軍，陳深樹(shù)，徐期林，陳垚翰，程良紅

(1.廣東南天司法鑒定所，廣東 深圳 518003； 2.深圳黑爾格科技有限公司，廣東 深圳 518109)

我國(guó)精神藥物的濫用問(wèn)題日益嚴(yán)重，致死人數(shù)不斷攀升，造成嚴(yán)重的社會(huì)問(wèn)題。目前流行的常見(jiàn)精神藥物包括甲基苯丙胺(冰毒)、海洛因、氯胺酮(K粉)、可待因、可卡因等。生物檢材中常見(jiàn)精神藥物的檢測(cè)結(jié)果通常作為公安和司法部門執(zhí)法的重要依據(jù)。與血、尿等其他生物檢材相比，毛發(fā)具有易獲取、易保存、目標(biāo)物穩(wěn)定、檢測(cè)時(shí)限長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)。因此，毛發(fā)中常見(jiàn)精神藥物的檢測(cè)吸引了各國(guó)科學(xué)家的廣泛關(guān)注，目前已發(fā)展出多種毛發(fā)樣品的前處理和檢測(cè)方法[1-4]。其中，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的應(yīng)用最為廣泛[5-7]。毛發(fā)的前處理方法包括堿性或酸性溶液消解、溶劑浸泡過(guò)夜、混合溶劑超聲波提取、酶水解法等。然而上述前處理方法使用大量溶劑，且提取時(shí)間較長(zhǎng)(10 h以上)，因此亟待開(kāi)發(fā)環(huán)保、高效的提取方法。

超臨界二氧化碳萃取(SFE)是一種新型的分離技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)便、環(huán)保、高效等特點(diǎn)。該技術(shù)利用超臨界二氧化碳的高效萃取能力，極大地提高了目標(biāo)物的提取效率，避免了固相萃取凈化等前處理步驟[8-9]，已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品及玩具檢測(cè)[10]等方面，但在法醫(yī)毒物領(lǐng)域的應(yīng)用相對(duì)較少[11]。 Sachs等[12]首次開(kāi)發(fā)了檢測(cè)毛發(fā)中毒品的超臨界二氧化碳萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)。Allena等[13]在26.2 MPa和70 ℃條件下，以氯仿和異丙醇(90∶10，體積比)為添加劑進(jìn)行超臨界二氧化碳萃取30 min，方法適用于毛發(fā)中苯丙胺類物質(zhì)的檢測(cè)。Cirimele等[14]在31.03 MPa和25 ℃條件下，以甲醇-三乙胺-水(2∶2∶1，體積比)為添加劑進(jìn)行超臨界二氧化碳萃取20 min，方法適用于毛發(fā)中阿片類物質(zhì)的檢測(cè)。 Brewer等[15]在29.6 MPa和145 ℃條件下,以甲醇為添加劑進(jìn)行超臨界二氧化碳萃取80 min(靜態(tài)萃取5 min，動(dòng)態(tài)萃取75 min)，方法亦適用于毛發(fā)中阿片類物質(zhì)的檢測(cè)。但是以上超臨界二氧化碳萃取方法只適用于單一種類精神藥物，且總體萃取效率低。本文通過(guò)改進(jìn)毛發(fā)樣本包裹材料以及萃取夾帶劑體系，優(yōu)化超臨界二氧化碳萃取條件，并結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜，開(kāi)發(fā)了一種具有普適性的毛發(fā)中11種常見(jiàn)精神藥物的提取和檢測(cè)方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290Ⅱ-6470 Triple Quad高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Agilent公司)，SFT-110XW超臨界CO2萃取儀(美國(guó)賽普泰克有限公司)，Water Purification System超純水機(jī)(美國(guó)Millipore公司)，TDZ5-WS離心機(jī)(湖南賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司)，Vortex kylin-bell@5旋渦混合儀(美國(guó)其林貝爾儀器制造有限公司)，KQ-250DE超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，HGC-12D氮?dú)鉂饪s儀(天津市恒奧科技發(fā)展有限公司)。

甲基苯丙胺(MAMP)、苯丙胺(AMP)、3,4-亞甲二氧基甲基苯丙胺(MDMA)、3,4-亞甲二氧基苯丙胺(MDA)、氯胺酮(Ketamine)、去甲氯胺酮(Norketamine)、可卡因(Cocaine)、苯甲酰愛(ài)康寧(BZE)、6-單乙酰嗎啡(6-MAM)、嗎啡(MOP)、可待因(Codeine)標(biāo)準(zhǔn)品(質(zhì)量濃度均為1.0 mg/mL)均購(gòu)自美國(guó)Cerilliant標(biāo)準(zhǔn)品公司；乙腈、甲醇和正己烷為色譜純(99.99%)，購(gòu)自德國(guó)Merck公司; 乙酸銨、甲酸為質(zhì)譜純，購(gòu)自百靈威試劑公司；三氟乙酸(99.9%)購(gòu)自阿拉丁試劑公司；實(shí)驗(yàn)用水由Milli-Q純水系統(tǒng)制備；鋼絲網(wǎng)(300、800目)購(gòu)于深圳方藝科技有限公司。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1.0 μg/mL)：準(zhǔn)確量取質(zhì)量濃度均為1.0 mg/mL的11種精神藥物標(biāo)準(zhǔn)品10 μL，分別置于10 mL容量瓶中,用少量甲醇溶解后定容至刻度，即得。

標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品：將1.0 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液分別稀釋10倍和100倍，得到100、10 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)液，精確稱量(20.0±0.1) mg空白毛發(fā)各6份，加適量丙酮至完全浸沒(méi)毛發(fā)后，依次添加20 μL 10 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)液，10、20、80 μL 100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)液，以及10、20 μL 1.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液，充分振蕩搖勻后過(guò)夜至丙酮揮干，得到毛發(fā)中加標(biāo)量為0.01、0.05、0.1、0.4、0.5、1 ng/mg的樣品，經(jīng)SFE萃取后，氮?dú)獯蹈?，添?00 μL甲醇稀釋，得到質(zhì)量濃度分別為2、10、20、80、100、200 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。

毛發(fā)樣品來(lái)源于深圳寶安戒毒所5名吸毒人員(編號(hào)為SZNTMF0007-0011)，經(jīng)深圳市生物醫(yī)學(xué)倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)(深圳倫審[2018]第(001)號(hào))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備依次用超純水和丙酮對(duì)毛發(fā)樣品進(jìn)行洗滌，晾干后剪碎至0.1～0.5 mm長(zhǎng)。萃取系統(tǒng)空白樣品：制備鋼絲網(wǎng)包(300～800目，1 cm×1 cm)，不添加任何樣品，用于監(jiān)控萃取系統(tǒng)是否有干擾?？瞻酌l(fā)樣品：準(zhǔn)確稱量20 mg剪碎后的空白毛發(fā)樣品，置于上述鋼絲網(wǎng)包中待測(cè)，以11種常見(jiàn)精神藥物均為未檢出進(jìn)行空白確認(rèn)，用于后續(xù)標(biāo)準(zhǔn)曲線建立以及方法精密度和回收率實(shí)驗(yàn)。添加樣品、質(zhì)控樣品：準(zhǔn)確稱量20 mg剪碎后的無(wú)吸毒人員毛發(fā)樣品，添加一定量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，晾干后置于鋼絲網(wǎng)包中，待測(cè)。實(shí)際毛發(fā)樣品：準(zhǔn)確稱量20 mg剪碎后的吸毒人員毛發(fā)樣品，洗滌晾干后置于鋼絲網(wǎng)包中，待測(cè)。

1.2.2 SFE萃取步驟將包裹20 mg毛發(fā)樣品的鋼絲網(wǎng)包置于萃取釜中；控制夾帶劑(5%三氟乙酸-95%甲醇)以1.5 mL/min流入萃取釜中，保持1 min后關(guān)閉；調(diào)節(jié)CO2流速至8 mL/min，將萃取釜升溫至130 ℃，出口溫度設(shè)為60 ℃，待溫度穩(wěn)定后開(kāi)始增壓。當(dāng)壓力增至31.03 MPa，開(kāi)始計(jì)算靜態(tài)萃取時(shí)間，4 min后打開(kāi)夾帶劑泵，以0.5 mL/min流速添加至萃取釜內(nèi)，同時(shí)打開(kāi)萃取釜出口閥門，開(kāi)始計(jì)算動(dòng)態(tài)萃取時(shí)間，收集5 min后完畢；濃縮后定容至100 μL上機(jī)分析。

1.2.3 色譜條件色譜柱：Poloshell 120 EC-C18(150 mm×2.0 mm×2.7 μm)；柱溫：30 ℃；流速：0.2 mL/min；進(jìn)樣量：1 μL；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：A為20 mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸水溶液，B為乙腈；梯度洗脫程序：0～3.50 min,10%～25% B; 3.50～4.50 min，25%～95% B; 4.50～5.00 min,95% B;5.00～5.01 min，95%～10% B;5.01～6.50 min，10% B。

1.2.4 質(zhì)譜條件離子源：電噴霧電離(ESI)，正離子模式；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；噴嘴電壓：500 V；毛細(xì)管電壓：4 000 V；干燥氣溫度：300 ℃；干燥氣流速：11 L/min；鞘氣溫度：350 ℃；鞘氣流速：11 L/min。11種常見(jiàn)精神藥物的毛細(xì)管出口電壓、碰撞能量、加速電壓及保留時(shí)間見(jiàn)表1。

表1 11種常見(jiàn)精神藥物的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)參數(shù)及保留時(shí)間Table 1 MRM parameters and retention times for 11 common psychotropic drugs

*quantitative ion

圖1 11種常見(jiàn)精神藥物的MRM色譜圖Fig.1 MRM spectra of 11 common psychotropic drugs the peak numbers denoted were the same as those in Table 1

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

本文11種常見(jiàn)精神藥物均為含氮原子的堿性化合物，流動(dòng)相中需添加甲酸酸化。以乙腈-20 mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相，可有效消除峰形拖尾現(xiàn)象,并能減少離子抑制效應(yīng)，增加目標(biāo)物的響應(yīng)值。在“1.2.3”條件下進(jìn)行梯度洗脫，可在10 min內(nèi)完成11種常見(jiàn)精神藥物的分離檢測(cè)，且分離度好，峰形尖銳。11種常見(jiàn)精神藥物的MRM色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在ESI正離子模式下，分別對(duì)11種常見(jiàn)精神藥物的單一標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行質(zhì)譜條件優(yōu)化。在噴嘴電壓500 V、毛細(xì)管電壓4 000 V、干燥氣溫度300 ℃、干燥氣流速11 L/min、鞘氣溫度350 ℃、鞘氣流速11 L/min條件下，使用全掃描(SCAN)模式選取各藥物的[M+1]峰作為母離子，在單離子監(jiān)測(cè)(SIM)模式下進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描,分別優(yōu)化了毛細(xì)管出口電壓、碰撞池能量、加速電壓等質(zhì)譜參數(shù)，最終確定各精神藥物的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)參數(shù)見(jiàn)表1。

2.3 樣品前處理的優(yōu)化

以最具代表性的6-單乙酰嗎啡、甲基苯丙胺、可卡因、氯胺酮為目標(biāo)物制備加標(biāo)0.2 ng/mg的毛發(fā)樣品，甲醇為夾帶劑，分別考察了SFE萃取溫度、壓力以及靜態(tài)和動(dòng)態(tài)萃取時(shí)間對(duì)萃取效率的影響。結(jié)果顯示，萃取效率隨著萃取溫度的升高而增大，溫度達(dá)130 ℃時(shí)的萃取效率最高，隨著溫度進(jìn)一步升高，萃取效率有所下降，這可能是由于毒品在高溫下部分分解所致。而萃取壓力對(duì)4種毒品萃取效率的影響較為平緩，隨著壓力的升高，萃取效率有所提升，當(dāng)壓力達(dá)31.03 MPa時(shí)，萃取效率最高，此后增加萃取壓力，萃取效率變化不大。此外，延長(zhǎng)靜態(tài)和動(dòng)態(tài)萃取時(shí)間有助于增加4種毒品的萃取效率，但靜態(tài)和動(dòng)態(tài)萃取時(shí)間分別超過(guò)4、5 min后萃取效率反而下降。綜上，確定最佳SFE萃取溫度為 130 ℃，壓力為31.03 MPa，靜態(tài)和動(dòng)態(tài)萃取時(shí)間分別為4、5 min。

分別以乙腈、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、5%甲酸-95%甲醇、5%三氟乙酸-95%甲醇、5%五氟乙酸-95%甲醇為夾帶劑，考察了其對(duì)上述加標(biāo)樣品中4種毒品萃取效率的影響。結(jié)果表明，以5%三氟乙酸-95%甲醇為夾帶劑時(shí)4種毒品的萃取回收率最高，這可能是由于堿性的毒品分子與有機(jī)強(qiáng)酸形成了離子對(duì)有機(jī)鹽，增加了其在水-甲醇中的溶解度，因此選擇5%三氟乙酸-95%甲醇作為夾帶劑。

進(jìn)一步對(duì)比了SFE萃取、甲醇超聲提取以及5%鹽酸溶液提取3種方法對(duì)加標(biāo)0.2 ng/mg的毛發(fā)樣品中4種毒品的相對(duì)提取效率。結(jié)果顯示，甲醇超聲提取法對(duì)于4種毒品的回收率為73.1%～81.4%，萃取時(shí)間為1 h；5%鹽酸溶液提取法的回收率為72.7%～80.1%，萃取時(shí)間為12 h。而SFE萃取法的回收率最高(85.2%～88.6%)，萃取時(shí)間最短(0.18 h)。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

按照“1.1”方法制備質(zhì)量濃度分別為2、10、20、80、100、200 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，每個(gè)濃度平行測(cè)定6次取平均值，分別以質(zhì)量濃度(ng/mL)為橫坐標(biāo)，MRM響應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行曲線擬合。結(jié)果表明，11種目標(biāo)物均在2～200 ng/mL范圍內(nèi)呈良好線性，相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.999。將添加系列質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)品的毛發(fā)樣品按照本方法進(jìn)行前處理后上機(jī)檢測(cè)，以信噪比(S/N)接近3時(shí)的濃度為方法檢出限(LOD)，以S/N接近10時(shí)的濃度為定量下限(LOQ)，得到方法LOD為0.01～0.05 ng/mg，LOQ為 0.03～0.10 ng/mg(見(jiàn)表2)。

表2 方法的相關(guān)系數(shù)、檢出限(LOD)、定量下限(LOQ)、回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 2 Correlation coefficients，limits of detection,limits of quantitation,recoveries and relative standard deviations of the method

2.5 回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

取空白毛發(fā)樣品分別進(jìn)行3個(gè)濃度水平(0.05、0.20、0.40 ng/mg)的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，按照本方法平行測(cè)定6次，計(jì)算其回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。由表2可知，11種目標(biāo)化合物在3個(gè)加標(biāo)水平下的回收率為81.6%～94.8%，RSD為0.50%～3.4%。

2.6 案例應(yīng)用

取20 mg實(shí)際吸毒人員的毛發(fā)樣品，按照本方法進(jìn)行前處理和檢測(cè)。典型樣品(編號(hào)SZNTMF0007)的MRM圖譜見(jiàn)圖2，該樣品檢出6-單乙酰嗎啡、可待因及嗎啡，含量分別為6.0、12、14 ng/mg，其中6-單乙酰嗎啡為海洛因的特征代謝物，與吸毒人員吸食海洛因的事實(shí)相吻合。樣品SZNTMF0008檢出甲基苯丙胺和苯丙胺，含量分別為51、10 ng/mg，與吸毒人員吸食冰毒的事實(shí)相吻合；樣品SZNTMF0009檢出氯胺酮、去甲氯胺酮和3，4-亞甲二氧基甲基苯丙胺，含量分別為16、7、54 ng/mg，與吸毒人員吸食K粉(氯胺酮)的事實(shí)相吻合；樣品SZNTMF0010檢出可卡因、苯甲酰愛(ài)康寧以及甲基苯丙胺，含量分別為35、25、38 ng/mg，與吸毒人員吸食可卡因和冰毒的事實(shí)相吻合；樣品SZNTMF0011檢出苯丙胺、甲基苯丙胺、氯胺酮以及去甲氯胺酮，含量分別為16、36、30、19 ng/mg，與吸毒人員吸食冰毒和K粉的事實(shí)相吻合。

分別采用本方法的SFE條件與最新發(fā)布的司法鑒定技術(shù)規(guī)范SF/Z JD0107025-2018[16]的前處理?xiàng)l件對(duì)SZNTMF0008樣品進(jìn)行處理，采用標(biāo)準(zhǔn)方法檢出甲基苯丙胺和苯丙胺的含量分別為43、8.9 ng/mg。本方法的定量結(jié)果略高于標(biāo)準(zhǔn)方法，主要原因是標(biāo)準(zhǔn)方法采用甲醇冰浴超聲提取30 min，提取溫度低使得提取效率略有下降。

另取SZNTMF0008樣品經(jīng)剪碎(0.1～0.5 mm)處理，與液氮冷凍研磨處理后進(jìn)行SFE提取對(duì)比，發(fā)現(xiàn)后者的定量結(jié)果略高，檢出甲基苯丙胺和苯丙胺的含量分別為76、18 ng/mg。主要原因是毛發(fā)樣品經(jīng)磨碎后目標(biāo)物更易被提取。綜合考慮前處理效率，本研究采用簡(jiǎn)易的毛發(fā)剪碎前處理方法。

圖2 典型樣品的MRM圖譜(SZNTMF0007)Fig.2 MRM spectra of typical sample(SZNTMF0007)

3 結(jié) 論

本文建立了一種超臨界二氧化碳萃取結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)毛發(fā)中11種常見(jiàn)精神藥物進(jìn)行定性和定量的檢測(cè)方法。該方法可在7 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)11種待測(cè)物的良好分離，精密度、線性關(guān)系和靈敏度等指標(biāo)滿足人體毛發(fā)中常見(jiàn)精神藥物的分析要求，可為公安和司法等相關(guān)部門執(zhí)法提供有力的技術(shù)支持。