弱激光預照射聯(lián)合有氧運動對增齡大鼠骨骼肌SIRTs/PGC-1α軸及IGF-1蛋白表達的影響

劉延瑩 楊海平 馮慶鯤 李方暉

1 肇慶學院體育與健康學院（廣東肇慶526000）

2 南京師范大學體育科學學院（江蘇南京210046）

肌肉減少癥是一種以骨骼?。á蛐图±w維為主）質量、肌力和功能增齡性減退為主要特征的退行性病變，已成為對老年人口危害最嚴重、影響最廣泛的全球性醫(yī)學難題之一。隨著人口老齡化的加速，肌肉減少癥的防治已成為重要的研究課題。長期以來，抗阻運動被認為是對抗肌肉減少癥的有效方式[1]。然而，老年人進行抗阻運動存在一定的難度和風險[2]。鑒于有氧運動對老年人心肺功能、體成分以及心血管健康有改善作用，往往作為老年人推薦的運動方式。研究顯示[3]，老年人進行9～12 個月適宜有氧運動后，腓腸?、裥秃廷騛 型肌纖維橫截面積均增大，毛細血管密度增多。此外，有氧運動可誘導老齡小鼠骨骼肌線粒體發(fā)生一系列適應性改變，對提高線粒體功能、防止肌細胞凋亡有重要意義[4]。然而，在臨床應用方面，肌肉減少癥患者的運動水平很低[5]，直接采用運動療法容易造成損傷[6，7]。

弱激光療法（low level laser therapy，LLLT）是通過照射生物系統(tǒng)產生光生物調節(jié)作用（photobiomodulation，PBM）來刺激或抑制生物功能的一種有效康復手段，不會對生物系統(tǒng)產生不可逆的損傷[8]。研究發(fā)現，LLLT 可用于肌肉減少癥的防護[9，10]。然而，單獨采用LLLT的作用較有限[11]。近年來，研究者逐漸探究LLLT和運動二者聯(lián)合對骨骼肌的調節(jié)作用。文獻報道，運動前采用LLLT 預照射不僅延遲骨骼肌疲勞發(fā)生[12]，而且有效提高骨骼肌功能和運動能力[13，14]。因此，運動前采用LLLT 預照射療法對運動水平較低的肌肉減少癥患者的治療具有重要借鑒意義。

然而，目前LLLT聯(lián)合有氧運動干預肌肉減少癥的機制尚不明確。線粒體穩(wěn)態(tài)失衡是肌肉減少癥發(fā)生機制之一[15，16]。研究指出，有氧運動效應主要是激活過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活子1α（peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator-1α，PGC-1α）引起線粒體生物合成增加[1]。PGC-1α是線粒體生物合成的關鍵調控者，對衰老骨骼肌線粒體穩(wěn)態(tài)調節(jié)起重要作用[17]。Ⅲ型組蛋白去乙?；福⊿irtuins，SIRTs）是乙酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotimide AdenosineDinucleotide+，NAD+）依賴的去乙酰化酶，在衰老和衰老相關性疾病中發(fā)揮重要調控作用[18]。SIRTs包括SIRT1-SIRT7七個家族成員。研究表明，SIRTs通過調控PGC-1α轉錄活性調節(jié)衰老骨骼肌線粒體穩(wěn)態(tài)[18，19]。胰島素樣生長因子1（insulin like growth factor 1，IGF-1）是骨骼肌蛋白質合成的重要調控因子，對于維持肌肉質量至關重要[20]。IGF-1 激活引起骨骼肌肥大效應是對抗增齡性肌肉減少的有效途徑[1]。事實上，PGC-1α與氧化應激、炎癥和骨骼肌蛋白質水解等多個信號通路之間存在“串流”[17]。Sendri 指出，PGC-1α可通過抑制叉頭轉錄因子（Forkhead box O，FOXO）的轉錄活性影響IGF-1/磷脂酰肌醇3 激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號軸降低衰老骨骼肌蛋白質降解[21]。Ruas等進一步研究發(fā)現，PGC-1α基因亞型PGC-1α4在肌纖維肥大效應中起重要作用，可能與激活IGF-1表達有關[22]。這些研究表明，IGF-1可能是PGC-1α的下游調控因子。因此，骨骼肌SIRTs-PGC-1α軸激活不僅有利于維持線粒體穩(wěn)態(tài)，還可能激活IGF-1。研究發(fā)現，LLLT[23]和體育運動[24]可以增加NAD+和其還原形式NADH的比值（NAD+/NADH），提高SIRTs 活性。然而，LLLT 聯(lián)合有氧運動如何調控SIRTs-PGC-1α軸？對IGF-1 蛋白表達的影響如何？尚不清楚。基于此，本研究探討LLLT聯(lián)合有氧運動對SIRTs-PGC-1α軸和IGF-1蛋白表達的影響，探討LLLT預照射聯(lián)合有氧運動對增齡骨骼肌肌肉質量減少的效應及可能機制，為肌肉減少癥的防治提供理論依據。

1 對象與方法

1.1 實驗動物分組

32只18月齡雌性SD大鼠購于廣州中醫(yī)藥大學動物中心，體重平均為378.4± 11.2 g，在室溫20～24℃、光照時間07：00～19：00 條件下，分籠飼養(yǎng)，適應性喂養(yǎng)1 周后，隨機分為安靜對照組（sedentary control，SC組）、有氧運動組（aerobic exercise，AE 組）、弱激光照射組（low level laser therapy，LLLT 組）和LLLT 預照射聯(lián)合有氧運動組（LLLT pre-irradiation combined aerobic exercise，LLLE組），每組各8只。

1.2 實驗方案

SC 組大鼠自由生活；AE 組參照Bejma 等[40]18月齡大鼠訓練負荷方案，進行為期8 周、速度15 m/min、坡度5°、每天15 min 跑臺運動，負荷強度相當于60%～75% VO2max；LLLT 組采用810 nm Ga-Al-As 激光器照射大鼠雙側大腿前側中間部分，每側照射兩個點，單點照射時間30 s，照射面積0.4 cm2，輸出功率50 mW，功率強度125 mW/cm2，能量密度為3.75 J/cm2，1 次/天，5 d/周，持續(xù)8 周；LLLE 組大鼠每次運動前進行弱激光預照射，方案分別同LLLT組和AE組，1次/天，5 d/周，連續(xù)8周。

1.3 測試指標與方法

1.3.1 腓腸肌指數

最后一次實驗結束48 h后將大鼠麻醉處死稱重，取兩側腓腸肌組織稱重并計算腓腸肌指數：腓腸肌指數=[腓腸肌質量（mg）/體重（g）]。

1.3.2 總mRNA提取及Real Time-PCR反應

取50～100 g 腓腸肌組織塊加入液氮和Trizol 在研缽中研磨成粉，然后按試劑說明書操作步驟進行總RNA 提取、逆轉錄反應和PCR 反應。所需試劑購自大連寶生物科技公司。去乙?；?-7（sirtuin1-7，SIRT1-7）、PGC-1 α、線 粒 體 轉 錄 因 子A（mitochondrial transcription factor a，TFAM）和核呼吸因子（nuclear respiratory factor 1，NRF-1）擴增引物基于Genebank查找序列采用Primer Express 3.0軟件設計，由上海英維捷基生物公司合成。以大鼠β-肌動蛋白（β-actin）作為內參，根據公式2-△△Ct計算目的基因的相對表達量。

表1 基因引物序列（5’-3’）

1.3.3 Western Blot測定IGF-1蛋白表達

使用RIPA裂解液裂解腓腸肌組織，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，并統(tǒng)一調成3 μg/μl，分裝，-80℃保存?zhèn)溆谩Ｈ〕龅鞍讟悠?，放入沸水中煮? 分鐘使蛋白變性，冷卻后待用。依據BCA 法所測的蛋白濃度，在上樣孔內加入等量的總蛋白。經12%SDS-PAGE 分離后，將蛋白轉至NC 膜上。用5%脫脂奶粉室溫封閉2 小時，洗滌后加入IGF-1 一抗（1︰200稀釋，購自Santa Cruz Biotechnology公司），4℃孵育過夜。次日用1 × TBST 洗膜10 min × 3 次，加山羊抗鼠二抗（1∶10000 稀釋，購自Santa Cruz Biotechnology公司），室溫孵育1.5 小時，1 × TBST 洗膜5 min × 4次。取適量ECL 熒光底物（購自Pierce 公司）A 液和B液按1∶1 比例混勻后，將膜浸泡其中，室溫孵育3～5 min后，用濾紙將膜表面液體擦干，并將其置于暗室，取醫(yī)用X光底片覆蓋，曝光1分鐘后，依次顯影、定影。

1.4 統(tǒng)計學處理

使用SPSS17.0 軟件進行數據處理，實驗結果均以均值±標準差（）表示，采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同干預方法對增齡大鼠腓腸肌質量和腓腸肌指數的影響

表2結果顯示，各組大鼠體重均沒有顯著性差異（P＞0.05）；與SC組相比，AE組、LLLT組和LLLE組腓腸肌質量（P＜0.05）和腓腸肌指數（P＜0.01）增加；LLLE 組腓腸肌指數高于AE組（P＜0.05）和LLLT組（P＜0.05）。

2.2 不同干預方法對增齡大鼠腓腸肌SIRTs 基因mRNA表達的影響

圖1結果顯示，與SC 組相比，AE 組SIRT1（P＜0.01）、SIRT2（P＜0.05）以及SIRT3-7 mRNA（P＜0.01）表達升高，LLLT 組SIRT1-5 mRNA（P＜0.05）表達升高，LLLE 組SIRT1（P＜0.01）、SIRT2（P＜0.05）、SIRT3（P＜0.01）、SIRT4（P＜0.05）、SIRT5（P＜0.01）和SIRT7 mRNA（P＜0.01）表達均升高；與AE 組相比，LLLT 組SIRT3 （P＜0.05）、SIRT6 （P＜0.01）和SIRT7 mRNA（P＜0.01）表達降低，LLLE 組SIRT1（P＜0.05）、SIRT3 mRNA（P＜0.01）表達升高，SIRT6 mRNA表達降低（P＜0.01）；與LLLT 組相比，LLLE 組SIRT1 mRNA （P＜0.05）、SIRT3（P＜0.01）和SIRT7 mRNA（P＜0.01）表達升高。

圖1 不同干預組增齡大鼠腓腸肌SIRT1-7 mRNA表達

2.3 不同干預方法對增齡大鼠腓腸肌線粒體生物合成相關基因mRNA表達的影響

圖2結果顯示，與SC組相比，AE組（P＜0.01）、LLLT組（P＜0.05）和LLLE 組（P＜0.01）的PGC-1α mRNA 表達水平均升高，LLLE組的PGC-1α mRNA 表達水平高于AE 組（P＜0.05）和LLLT 組（P＜0.01）；與SC 組相比，AE 組、LLLT 組和LLLE 組NRF-1 mRNA（P＜0.05）和TFAM mRNA（P＜0.01）表達水平升高，三組間無顯著性差異（P＞0.05）。

圖2 不同干預組增齡大鼠腓腸肌PGC-1α、NRF-1和TFAM mRNA表達

2.4 不同干預方法對增齡大鼠腓腸肌IGF-1蛋白表達的影響

圖3結果顯示，與SC組相比，AE組（P＜0.05）、LLLT組（P＜0.05）和LLLE組（P＜0.01）的IGF-1蛋白表達水平均升高；LLLE組的IGF-1蛋白表達水平高于AE組（P＜0.05）和LLLT組（P＜0.05）。

圖3 不同干預組增齡大鼠腓腸肌IGF-1蛋白表達

3 討論

增齡過程伴隨骨骼肌質量減少，是肌肉減少癥的典型特征。動物研究表明，大鼠性成熟期（6～12月齡）后，后肢骨骼肌質量逐漸下降，表現為肌纖維數目和橫截面積減少，到老年期約減少20%～25%[11]。Marzetti 等[25]研究不同月齡（8、18、29 和37月齡）大鼠腓腸肌質量變化趨勢發(fā)現，大鼠骨骼肌質量從18月齡開始下降，隨著年齡增加逐漸下降并伴隨DNA 凋亡片段的增加。也有研究發(fā)現，大鼠增齡至22月齡時，腓腸肌質量和體積均顯著下降[26]，腓腸肌質量和腓腸肌指數分別比3月齡年輕大鼠降低24%和20%[27]。本研究選取18月齡自然衰老的雌性大鼠，干預8周后終止實驗，即最終研究對象為20月齡大鼠。結合上述文獻推測，本研究大鼠在20月齡時已經出現明顯的增齡性骨骼肌質量減少。

3.1 弱激光預照射聯(lián)合有氧運動對增齡大鼠腓腸肌質量的影響

體育運動是應對肌肉減少癥的有效措施[28]。耐力運動過程中，骨骼肌被長時間動員，可促進肌纖維橫截面積、線粒體體積、線粒體酶活性和抗氧化水平增加、抑制凋亡信號，誘導骨骼肌產生良好適應。Pasini 等[29]研究發(fā)現，8周大強度運動可使16～18月齡增齡大鼠肌肉減少癥得到明顯改善。Song 等[30]研究揭示，12 周中等強度大負荷量（15 m/min，15° incline，60 min/day，5 days/week）運動使27月齡增齡大鼠腓腸肌質量增加了14.4%。Kang 等[31]研究報道，12 周中等強度跑臺運動（17.5 m/min，10%坡度）使22月齡增齡大鼠比目魚肌質量增加6%，比目魚肌指數增加11%。本研究發(fā)現，8 周中等強度低負荷量有氧運動（60%～75%VO2max，15 m/min，5° incline，15 min/day）誘導20月增齡大鼠腓腸肌質量和腓腸肌指數分別增加23%和19.4%。然而，Andersen 等[26]發(fā)現，18月齡雌性增齡大鼠經過9 周適度跑臺運動（5 days/week，1 h/day，8 m/min）后，腓腸肌質量和體積均沒有顯著增加。漆正堂等[4]研究也發(fā)現，以65%～75%最大負荷進行每天1 h連續(xù)4 周耐力運動后，老齡小鼠骨骼肌不但質量沒有改變，而且DNA 氧化損傷可能加劇。由此可見，盡管有氧運動可作為干預增齡性骨骼肌質量減少的有效手段，但具體實施方案可能有待于進一步優(yōu)化。

目前，LLLT在改善肌肉功能和治療肌萎縮方面顯示出良好的應用前景。Nakano 等[10]研究揭示，LLLT 可通過刺激肌衛(wèi)星細胞增殖和血管生成促進廢用性萎縮骨骼肌康復。Corazza 等[9]發(fā)現，連續(xù)12 周LLLT（850 nm，100 mW，120 J/cm2，0.5 cm2）照射可顯著增加圍絕經期大鼠股直肌體積分數。本研究發(fā)現，來自Ga-Al-As 激光器的LLLT（810 nm，125 mW/cm2，0.4 cm2，30 s）照射處理8周（1次/天，5次/周），腓腸肌質量和腓腸肌指數分別比對照組增加18%和15%，表明單獨LLLT 對增齡大鼠骨骼肌質量減少也具有一定效果。然而，LLLE組大鼠的腓腸肌質量和腓腸肌指數升高更為明顯，分別比對照組增加37.7%和37.5%?？梢?，LLLE 干預能更有效阻止增齡大鼠骨骼肌質量減少。Amadio 等[11]研究也發(fā)現，LLLT（808 nm，1.071 W/cm2，0.028 cm2，40 s）預照射聯(lián)合游泳運動（90 min/day，6 days/week）干預6 周可將老齡大鼠顯著減少的腓腸肌橫截面積恢復到年輕大鼠水平，單獨運動也能引起老齡大鼠腓腸肌橫截面積顯著增加，然而單獨LLLT 沒有顯著效果。盡管本研究沒有測定腓腸肌橫截面積，但從腓腸肌質量和腓腸肌指數評價指標不難發(fā)現，LLLE 對增齡性肌肉減少干預效果優(yōu)于單獨LLLT或AE干預，二者可能具有疊加效應，與我們的研究結果一致。

3.2 弱激光預照射聯(lián)合有氧運動對增齡大鼠骨骼肌SIRTs基因和線粒體生物合成相關基因表達的影響

線粒體生物合成能力下降導致骨骼肌線粒體穩(wěn)態(tài)失調，是肌肉減少癥發(fā)生機制之一[15，16]。PGC-1α是線粒體生物合成的主要調控者，可調控下游基因如NRF-1 和TFAM 表達，對骨骼肌線粒體穩(wěn)態(tài)調節(jié)起重要作用。SIRTs 是哺乳動物衰老過程主要的調控因子[32]。研究指出，SIRTs在抗氧化防御、線粒體動力學、自噬等線粒體應激反應中起至關重要的作用[33]。SIRTs 可通過去乙酰化調控PGC-1α轉錄活性，調節(jié)線粒體生物合成[18，19]。可見，SIRTs-PGC-1α軸對調控骨骼肌線粒體生物合成，維持衰老骨骼肌線粒體穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要作用。

SIRTs 是體育運動發(fā)揮有益效應的分子基礎[24]。目前，運動對SIRT1和SIRT3的影響研究較多。耐力運動訓練后，增齡骨骼肌SIRT1和SIRT3活性升高[34]。然而，運動對骨骼肌SIRT2、SIRT4～SIRT7 的影響研究較少。本研究發(fā)現，8 周中等強度AE 促進增齡大鼠腓腸肌SIRT1～7 mRNA表達水平均顯著升高。耐力運動是刺激PGC-1α表達的有效方式[17]。體育運動過程中，細胞能量感受器腺苷酸活化蛋白激酶（AMP activated protein kinase，AMPK）激活引起NAD+/NADH 比值增加，進而激活SIRTs，同時AMPK誘導PGC-1α磷酸化并使其在隨后的SIRTs 去乙?；^程中激活[35]。本研究發(fā)現，8 周AE 后，腓腸肌PGC-1α、NRF-1 和TFAM mRNA 表達均顯著增加。提示，AE 可能激活SIRTs/PGC-1α軸，增加NRF-1 和TFAM mRNA 表達，提高增齡大鼠骨骼肌線粒體生物合成，有利于維持衰老骨骼肌線粒體穩(wěn)態(tài)。

LLLT 可以增加NAD+/NADH 比值[23]，提高SIRTs 活性。本研究發(fā)現，8 周LLLT 誘導增齡骨骼肌SIRT1-5 mRNA、PGC-1α、NRF-1 和TFAM mRNA 表達均增加?？梢?，LLLT 在一定程度上影響增齡骨骼肌SIRTs水平，引起PGC-1α下游基因mRNA表達改變。本研究還發(fā)現，LLLE誘導增齡大鼠骨骼肌SIRT1-7、PGC-1α、NRF-1 和TFAM mRNA 水平均升高。此外，LLLE 組SIRT1和SIRT3 mRNA水平均高于AE組和LLLT組，這與LLLE 對PGC-1α mRNA 的影響效果恰好一致。研究揭示，SIRT1和SIRT3去乙?；⒓せ頟GC-1α，在調控線粒體功能方面具有協(xié)同作用[36]。據此推測，LLLE可能主要通過雙重調控SIRT1/SIRT3-PGC-1α軸，誘導NRF-1和TFAM表達，提高線粒體生物合成能力，從而實現對衰老骨骼肌線粒體穩(wěn)態(tài)調控。

3.3 弱激光預照射聯(lián)合有氧運動對增齡大鼠骨骼肌IGF-1蛋白表達的影響

骨骼肌蛋白質合成減少和降解增加是肌肉減少癥發(fā)生重要機制之一。研究發(fā)現[37]，IGF-1一方面通過激活PI3K/Akt/mTOR 通路促進蛋白質合成，另一方面通過抑制氧化應激誘導的線粒體功能失調和細胞色素c釋放保護細胞免于凋亡，在延緩增齡性骨骼肌丟失中起重要作用。長期以來，抗阻運動被認為是刺激IGF-1表達的最有效方式[1]。本研究發(fā)現，8周AE也可引起增齡大鼠骨骼肌中IGF-1蛋白表達增加。骨骼肌中IGF-1 表達可以被LLLT 所促進[38]。本研究發(fā)現，8 周LLLT可促進增齡大鼠骨骼肌IGF-1 蛋白表達。此外，LLLE組IGF-1 蛋白表達極顯著升高。Corazza 等[9]發(fā)現，LLLT、抗阻運動以及LLLT聯(lián)合抗阻運動可顯著增加切除卵巢大鼠股直肌IGF-1濃度和體積分數。遺憾的是，本研究沒有進行形態(tài)學測定，但結合腓腸肌質量和指數測定結果不難發(fā)現，AE組、LLLT組和LLLE組IGF-1蛋白的變化與腓腸肌質量和腓腸肌指數改變一致。提示，IGF-1蛋白表達增加促進增齡骨骼肌質量增加。

本研究還發(fā)現，LLLE 促進IGF-1 蛋白表達效果優(yōu)于AE 和LLLT。這與LLLE 對SIRT1、SIRT3 和PGC-1α mRNA的影響效應一致。研究揭示[17]，PGC-1α牽涉在控制肌肉質量和功能的一系列細胞事件中。PGC-1α水平升高可通過降低凋亡、自噬和蛋白酶體降解阻止衰老骨骼肌質量減少[39]。Sendri[21]發(fā)現，PGC-1α可通過IGF/PI3K/AKT/mTOR 軸降低衰老骨骼肌蛋白質降解。Ruas等[22]研究進一步發(fā)現，PGC-1α亞型PGC-1α4表達增加可引起IGF-1 表達增加和肌肉生長抑制素myostatin基因表達降低，誘導肌纖維肥大。有趣的是，PGC-1α4 轉基因表達小鼠，其骨骼肌質量和力量均增加[22]。這些研究表明，IGF-1 可能是PGC-1α的下游調控因子。結合上述LLLE 對增齡大鼠肌肉減少的干預效果以及對SIRT1/SIRT3-PGC-1α軸的調控作用，可以推測，LLLE促進增齡大鼠骨骼肌質量增加可能主要與LLLE 雙重調控SIRT1/SIRT3-PGC-1α軸，一方面促進NRF-1和TFAM mRNA表達，維持線粒體穩(wěn)態(tài)，同時激活IGF-1蛋白表達有關。

4 結論

弱激光預照射聯(lián)合有氧運動對增齡性骨骼肌質量減少干預效果優(yōu)于有氧運動和弱激光療法，可能主要依賴于雙重調控SIRT1/SIRT3-PGC-1α軸，一方面提高增齡骨骼肌線粒體生物合成能力，維持線粒體穩(wěn)態(tài)，另一方面，激活增齡骨骼肌IGF-1蛋白表達。