miR-18a對人正常滋養(yǎng)細(xì)胞中MMP-2、MMP-9表達(dá)的影響

楊洋，陳蕊，王穩(wěn)瑩，劉成娟

子癇前期（pre-eclapmpsia，PE）是產(chǎn)科常見疾病，母胎病死率高，但發(fā)病原因尚未明確[1-2]。近期研究表明，滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤能力下降、子宮螺旋動脈重塑異常最終引發(fā)致胎盤功能障礙可能是PE的病理基礎(chǔ)和主要病因?qū)W說[3-4]。妊娠早期，滋養(yǎng)細(xì)胞的正常浸潤保證了胎盤形成及正常妊娠的成功；滋養(yǎng)細(xì)胞分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）、MMP-9能夠降解胞外基質(zhì)相關(guān)組分，幫助其順利侵入子宮[5]。作為滋養(yǎng)細(xì)胞自身直接分泌的細(xì)胞功能因子，MMP-2、MMP-9表達(dá)異常會影響正常妊娠，并導(dǎo)致多種妊娠相關(guān)疾病的發(fā)生。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類非編碼小分子 RNA，通過與靶 mRNA 的 3′非編碼區(qū)（3′-UTRs）結(jié)合后調(diào)控相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄翻譯及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[6]，影響細(xì)胞生理過程。部分miRNA能夠影響滋養(yǎng)細(xì)胞功能，可能與PE發(fā)病相關(guān)[7-8]。筆者所在課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，PE胎盤組織中病理性低表達(dá)的miR-18a能夠靶向調(diào)控雌激素受體α（ER-α）[9-10]，并影響滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤[11]，進(jìn)一步明確了PE相關(guān)miR-18a對滋養(yǎng)細(xì)胞功能的影響作用，但機(jī)制未明。然而有研究發(fā)現(xiàn)，通過ER-α介導(dǎo)的雌二醇（E2）能夠間接影響滋養(yǎng)細(xì)胞表達(dá) MMP-2、MMP-9[12]。另外，miR-18a也能通過對其他靶基因的調(diào)控影響MMP表達(dá)，影響滋養(yǎng)細(xì)胞功能[13]。HTR-8細(xì)胞為人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞，是目前與體內(nèi)滋養(yǎng)細(xì)胞正常生理功能最為接近，且被相關(guān)研究領(lǐng)域認(rèn)可的正常滋養(yǎng)細(xì)胞功能研究的良好模型，筆者所在課題組在前期研究中已應(yīng)用該細(xì)胞系完成了部分miRNA功能研究，證明該細(xì)胞系是研究滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤功能的良好模型[9-10]。本研究旨在分析miR-18a是否能夠通過對細(xì)胞浸潤相關(guān)因子MMP-2、MMP-9表達(dá)的調(diào)節(jié)影響滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤能力。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑、儀器 HTR-8細(xì)胞由空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院婦產(chǎn)科惠贈。DMEM-F12培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購自美國Gibco公司；TRIzol Reagent購自美國Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）試劑盒購自日本TaKaRa公司；miR-18a前體分子（pre-miR-18a），包括 miR-18a類似物（miR-18a mimics）、miR-18a抑制物（miR-18a inhibitor）以及羧基熒光素（FAM）標(biāo)記 miR-18a空白載體（NC）均購自中國上海吉瑪生物公司；Opti-MEM培養(yǎng)基及LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；PCR引物中國北京奧科公司合成；細(xì)胞裂解液、蛋白定量試劑盒購自中國科昊生物公司；FITC-鼠抗人MMP-2、MMP-9單克隆抗體、鼠抗人GAPDH單克隆抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗鼠抗體購自英國Abcam公司；RT-qPCR分析儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 HTR-8細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將凍存的HTR-8細(xì)胞解凍后接種于RPMI-1640完全培養(yǎng)液（含10%FBS），調(diào)整細(xì)胞數(shù)后接種于培養(yǎng)皿中，置于5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中；待細(xì)胞生長密度至70%左右時行轉(zhuǎn)染實驗。分組：miR-18a過表達(dá)組、miR-18a抑制組、陰性對照組（轉(zhuǎn)染實驗選取6孔板進(jìn)行）。消化待轉(zhuǎn)染HTR-8細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度，按照LipofectamineTM2000說明書配制轉(zhuǎn)染試劑，配制時避光進(jìn)行；將轉(zhuǎn)染液逐一加入到對應(yīng)孔徑中，并設(shè)置陰性對照，隨即將細(xì)胞放入培養(yǎng)箱，6 h后第1次換液為RPMI-1640完全培養(yǎng)液（含10%FBS）；隨即于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率、記錄結(jié)果。

1.3 RT-qPCR檢測轉(zhuǎn)染后HTR-8細(xì)胞中 miR-18a、MMP-2、MMP-9 mRNA的表達(dá) 轉(zhuǎn)染后48 h使用TRIzol Reagent提取HTR-8細(xì)胞總RNA，測定RNA質(zhì)量后保存待用。根據(jù)PrimerBank公布的基因序列設(shè)計miR-18a、MMP-2、MMP-9及內(nèi)參U6、β-actin的引物序列，具體序列，見表1；吸取 1 μL（1 μg/μL） 總 RNA 為模板，反轉(zhuǎn)錄合成 miR-18a cDNA；根據(jù)TaKaRa RT-qPCR試劑盒說明配制反應(yīng)體系后加樣，以U6為內(nèi)參，進(jìn)行PCR，具體反應(yīng)條件見表1。

表1 目的基因引物序列及PCR反應(yīng)條件

檢測時每個樣本重復(fù)5次。以上在每個PCR循環(huán)的延伸期采集熒光信號，PCR完成后利用溫度梯度變性獲得熔解曲線供PCR產(chǎn)物定性分析。根據(jù)PCR擴(kuò)增曲線，得到每個樣本的循環(huán)周期數(shù)（Ct值），使用2-△△Ct法計算各組中目的基因mRNA的相對表達(dá)量。

1.4 蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）檢測轉(zhuǎn)染后HTR-8細(xì)胞中MMP-2、MMP-9的表達(dá) 轉(zhuǎn)染后48 h使用細(xì)胞裂解液提取HTR-8細(xì)胞蛋白，并檢測蛋白濃度。取30 μg蛋白進(jìn)行電泳，半干法轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上，將膜置于含5%脫脂奶粉封閉液中，封閉1 h；加一抗鼠抗人MMP-2、MMP-9 單抗（1∶2 500）、鼠抗人 GADPH 單抗（1∶1 500），室溫孵育2 h；棄一抗后加HRP標(biāo)記的山羊抗鼠抗體（1∶5 000）二抗孵育1 h；化學(xué)發(fā)光反應(yīng)后，顯影、定影，用BIO-RAD成像系統(tǒng)對X光片掃描成像，記錄灰度值并行半定量分析，目的蛋白的相對表達(dá)量以MMP-2/GADPH、MMP-9/GADPH比值表示。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件分析，定量資料正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；兩組間比較用兩獨立樣本均數(shù)的t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 熒光顯微鏡下觀察miR-18a轉(zhuǎn)染效率 HTR-8細(xì)胞中過表達(dá)與抑制miR-18a后6 h，于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率約為90%，見圖1（見后插二）。

2.2 3組HTR-8細(xì)胞轉(zhuǎn)染后miR-18a、MMP-2、MMP-9 mRNA表達(dá)量的比較 3組HTR-8細(xì)胞轉(zhuǎn)染后 miR-18a、MMP-2、MMP-9 mRNA 表達(dá)量的比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.001）。miR-18a過表達(dá)組miR-18a mRNA表達(dá)量比陰性對照組升高，miR-18a抑制組miR-18a mRNA表達(dá)量比陰性對照組降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.001）。miR-18a抑制組MMP-2、MMP-9 mRNA表達(dá)量比陰性對照組降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.001）。見表2。

表2 3組HTR-8細(xì)胞轉(zhuǎn)染后miR-18a、MMP-2、MMP-9 mRNA 表達(dá)量的比較（±s）

表2 3組HTR-8細(xì)胞轉(zhuǎn)染后miR-18a、MMP-2、MMP-9 mRNA 表達(dá)量的比較（±s）

分組 n miR-18a MMP-2 MMP-9 miR-18a過表達(dá)組① 5 1.04±0.13 0.94±0.09 1.03±0.09陰性對照組② 5 0.61±0.07 0.92±0.06 1.04±0.12 miR-18a抑制組③ 5 0.35±0.05 0.34±0.07 0.49±0.07 F（P） 73.130（＜0.001） 90.640（＜0.001） 52.350（＜0.001）組間比（P）①∶② ＜0.001 0.780 0.720③∶② ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001①∶③ ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.3 抑制miR-18a后MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)量的比較 miR-18a抑制組MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)量較陰性對照組降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.010），見表 3、圖 2。

表3 抑制miR-18a后MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)量的比較（±s）

表3 抑制miR-18a后MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)量的比較（±s）

組別 n MMP-2 MMP-9陰性對照組 5 1.05±0.10 1.05±0.07 miR-18a抑制組 5 0.78±0.04 0.79±0.06 t 5.626 6.307 P＜0.001 ＜0.001

圖2 抑制miR-18a后MMP-2、MMP-9蛋白Western blotting圖

3 討論

作為常見的妊娠期疾病，PE在我國發(fā)生率較高[14]，因其病因不明，且缺乏安全有效的早期診斷預(yù)測方法，往往發(fā)病時孕婦機(jī)體已發(fā)生了不可逆轉(zhuǎn)的病理生理變化，導(dǎo)致圍生期母嬰死亡率較高[15]，臨床并發(fā)癥多。近年來，關(guān)于PE的病因?qū)W研究領(lǐng)域取得了一定進(jìn)展，滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤能力下降及胎盤功能異常因素引發(fā)一系列機(jī)體變化[3-4]，逐漸成為其主要病因?qū)W說。

miRNA通過對其靶基因調(diào)控，影響多種人體生理過程，參與包括PE在內(nèi)的諸多疾病過程。PE患者的miRNA主要通過影響滋養(yǎng)細(xì)胞功能涉及胎盤淺著床、子宮螺旋動脈重鑄障礙等一系列病理過程[8,16-17]。Zhu等[9]發(fā)現(xiàn)了在PE患者胎盤組織中低表達(dá)的miR-18a，筆者后續(xù)研究中進(jìn)一步驗證了其與PE的相關(guān)性[10]。此外，體外細(xì)胞功能實驗發(fā)現(xiàn)抑制miR-18a的表達(dá)可明顯降低HTR-8的浸潤能力，但其機(jī)制未明。本研究選擇HTR-8細(xì)胞作為體外細(xì)胞實驗?zāi)Ｐ?，并在該?xì)胞系中過表達(dá)與抑制miR-18a表達(dá)，效果顯著，這與筆者前期研究相一致。miR-18a是通過何種途徑實現(xiàn)其對滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤功能的影響，以及是否能夠直接影響細(xì)胞浸潤相關(guān)因子的表達(dá)，從而參與細(xì)胞浸潤功能調(diào)節(jié)過程均值得探究。

多種定位于胎盤組織中的蛋白及細(xì)胞因子影響滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤功能，可能參與PE發(fā)病[18]。MMP-2和MMP-9更是在滋養(yǎng)細(xì)胞的浸潤調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要作用，并借此參與維系妊娠[19]。本研究發(fā)現(xiàn)抑制miR-18a的表達(dá)能同時影響HTR-8細(xì)胞中MMP-2、MMP-9在mRNA和蛋白水平的表達(dá)，說明miR-18a能夠在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平調(diào)控MMP-2、MMP-9的表達(dá)，從而影響滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤能力。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)miR-18a與ER-α間具有負(fù)性靶向調(diào)控關(guān)系，ER-α是人體內(nèi)E2發(fā)揮其生理效應(yīng)的重要介質(zhì)[10]，而胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7（insulin-like growth factor binding protein 7，IGFBP7）表達(dá)受體內(nèi)雌激素水平調(diào)控，E2在其中發(fā)揮關(guān)鍵作用；IGFBP7能進(jìn)一步抑制滋養(yǎng)細(xì)胞中MMP-2、MMP-9的表達(dá)，從而影響滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤[12]；故推測發(fā)生PE時，低表達(dá)的miR-18a可能通過該途徑間接導(dǎo)致IGFBP7過表達(dá)，從而加重滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤障礙，參與疾病過程。

另外，Song等[13]發(fā)現(xiàn)miR-18a能在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中靶向調(diào)控再生蛋白（Neogenin），從而影響腫瘤細(xì)胞的浸潤、凋亡；而Neogenin可直接影響人絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞MMP-9的表達(dá)，調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤[20]。雖然PE相關(guān)miRNA能夠調(diào)控母體環(huán)境中部分細(xì)胞因子和蛋白，影響滋養(yǎng)細(xì)胞功能、胎盤發(fā)育和妊娠結(jié)局；但一個miRNA可靶向調(diào)控若干靶基因，而這些靶基因不一定直接參與細(xì)胞功能調(diào)控過程。因此，PE時miR-18a也可能通過對不同靶基因的調(diào)控作用，直接或間接影響了細(xì)胞浸潤相關(guān)因子MMP-2、MMP-9的表達(dá)，進(jìn)而參與了抑制滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤能力的調(diào)控過程。其中涉及的具體機(jī)制，筆者后續(xù)會深入研究。

本研究初步探討了PE相關(guān)miR-18a影響滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤能力的部分機(jī)制，為進(jìn)一步探索PE病因，以及miRNA在PE預(yù)測、臨床診治中應(yīng)用提供了部分參考。