色素上皮衍生因子通過抑制PI3K/Akt通路降低宮頸癌HeLa細胞活性和侵襲相關(guān)蛋白表達

周洋，金志軍，王丹，吳玉仙，王成才

宮頸癌是惡性程度極高的婦科惡性腫瘤之一， 其發(fā)病率和死亡率在惡性婦科腫瘤中僅次于乳腺癌[1]。宮頸癌的惡性生物學(xué)特征主要是癌細胞的過度增殖和侵襲，但至今仍未明確其具體的調(diào)控機制[2]。磷脂酰肌醇 3 激酶（PI3K）/蛋白激酶 B（Akt）信號通路參與許多腫瘤的重要生物學(xué)過程，包括細胞的增殖凋亡、轉(zhuǎn)錄翻譯、能量代謝和細胞周期調(diào)控等[3]。研究表明在人乳頭瘤病毒（HPV）陽性的宮頸鱗狀細胞癌中，PI3K/Akt信號通路經(jīng)常被激活，且與腫瘤細胞的增殖和存活有關(guān)[4-5]。

色素上皮衍生因子（PEDF）是絲氨酸蛋白酶超家族成員之一的多功能旁分泌糖蛋白，其廣泛分布于人體大多數(shù)組織和器官[6]。最近有研究表明，PEDF具有較強的抗腫瘤作用，主要是通過抑制腫瘤血管新生從而造成腫瘤細胞凋亡實現(xiàn)的[7]。據(jù)報道，在小鼠宮頸癌組織中PEDF表達量下降，且通過外源性注射PEDF的方式可使宮頸癌腫塊縮小68%，腫瘤組織微血管密度顯著下降[8]。但PEDF的抗腫瘤作用是否與調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路有關(guān)目前尚不明確。c-Met即肝細胞生長因子受體（hepatocyte growth factor receptor,HGFR）是原癌基因的編碼產(chǎn)物。c-Met在多種惡性腫瘤中呈高表達，除了有刺激細胞增殖、血管新生及阻止細胞凋亡等作用外，還可促進腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移，故被認(rèn)為是腫瘤侵襲相關(guān)蛋白[9-10]。而PEDF對腫瘤組織中c-Met蛋白表達的影響目前也有待確認(rèn)。因此，本研究通過建立PEDF蛋白預(yù)處理的宮頸癌HeLa細胞模型，探究PEDF對腫瘤細胞活性和侵襲相關(guān)蛋白表達的作用是否與PI3K/Akt通路的調(diào)節(jié)有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 病例資料 本研究標(biāo)本來自于上海長征醫(yī)院病理科收集的2016年10月—2018年10月手術(shù)切除后經(jīng)病理學(xué)診斷確診的40例宮頸癌組織及其對應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本，患者年齡 28～75歲，平均年齡（50.5±10.1）歲，其中≤50歲 18例，＞50歲22例；腫瘤直徑大小≤4 cm者24例，＞4 cm者16例；腫瘤浸潤≤1/2肌層者10例，＞1/2肌層者30例；病理分級Ⅰ級6例，Ⅱ級11例，Ⅲ級23例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性者25例，陽性者15例。

1.2 主要材料和儀器 人宮頸癌HeLa細胞株購自上海中科院細胞典藏館；人正常宮頸上皮HCerEpiC細胞株購自美國ScienCell公司；胎牛血清（FBS，#10100154）和 DMEM 高糖培養(yǎng)基（#10566024）購自美國Gibco公司；免疫組織化學(xué)ABC試劑盒（#AK-5200）和 DAB 顯色劑（#SK-4100）購自美國Vector公司；CCK-8細胞活性測定試劑盒（#CK04）購自日本Dojindo公司；重組人PEDF蛋白（#ab86705）購自英國Abcam公司；PI3K 抑制劑 LY294002（#1130）、Akt抑制劑 GSK 690693（#4144）、PI3K 激活劑 740 Y-P（#1983）和 Akt激活劑IGF-1（#291-G1）購自美國R&D公司；PEDF多克隆抗體（#ab180711）、PI3K多克隆抗體（#ab154598）、p-Akt多克隆抗體（#ab38449）、Akt單克隆抗體（#ab179463）、c-Met單克隆抗體（#ab51067）和 β-actin單克隆抗體（#ab8226）購自英國Abcam公司。細胞兩氣培養(yǎng)箱購自美國Thermo Scientific公司；倒置熒光顯微鏡和PM-CB20顯微照相系統(tǒng)購自日本Olympus公司；Synegy2多功能酶標(biāo)儀購自美國BioTek公司；Odyssey凝膠掃描儀購自美國Li-cor公司。

1.3 細胞培養(yǎng)及預(yù)處理 HeLa細胞和HCerEpiC細胞培養(yǎng)基使用含有10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，并放入37℃、5%CO2的常氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞每2～3 d傳代1次，傳代時用胰酶使細胞懸浮，并用DMEM培養(yǎng)基洗滌2次，將細胞懸液按1∶3稀釋后傳代。細胞蛋白提取前，預(yù)先2 h在細胞培養(yǎng)基中加入10 nmol/L PEDF蛋白或按推薦濃度加入LY294002、GSK 690693（30 μmol/L）、740 Y-P（50 g/L）或 IGF-1（100 mg/L）。筆者所在研究團隊的前期結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HeLa細胞在使用 PEDF 濃度梯度（1、5、10、20和 40 nmol/L）處理后，10 nmol/L的PEDF劑量對HeLa細胞活性和侵襲相關(guān)蛋白水平的抑制作用最顯著，低于或者高于10 nmol/L的劑量對HeLa細胞的抑制作用均低于10 nmol/L（結(jié)果尚未發(fā)表），因此在本研究中使用PEDF的濃度為10 nmol/L。

1.4 免疫組織化學(xué)ABC法和染色結(jié)果判定 取得宮頸癌組織及癌旁組織樣本后，立即于10%甲醛溶液中固定過夜，經(jīng)梯度酒精脫水，浸二甲苯和石蠟，然后進行包埋，切成4 μm的切片，存放于4℃冰箱備染。

1.4.1 免疫組織化學(xué)ABC方法 二甲苯脫蠟、梯度酒精水化；3%H2O2室溫10 min滅活內(nèi)源性酶；磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗后，進行高壓加熱抗原修復(fù)；恢復(fù)室溫后，PBS清洗切片，用檢測抗體所對應(yīng)的血清封閉30 min，加一抗后4℃過夜；次日依次滴加生物素化二抗及ABC試劑，室溫下各孵育30 min，PBS清洗；DAB顯色；蘇木素復(fù)染；鹽酸酒精分化后脫水、透明，封片晾干，于倒置熒光顯微鏡的明場下觀察分析。

1.4.2 免疫組織化學(xué)染色評分標(biāo)準(zhǔn) 染色強度分為4個等級：無著色計0分，淺黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分；染色面積分為4個等級：陽性細胞占0～5%計0分，6%～25%計1分，26%～50%計2分，50%以上計3分；染色最后得分為染色強度與染色面積的乘積：0～1分為陰性，2～5分為弱陽性，6～8分為中陽性，9分為強陽性。

1.5 細胞活性測定（CCK-8法） 細胞經(jīng)胰酶消化后，按104/孔的數(shù)量將細胞懸液接種到96孔板中，每孔100 μL。培養(yǎng) 24 h后，將 10 μL 的 2-（2-甲氧基-4-硝苯基）-3-（4-硝苯基）-5-（2，4-二磺基苯）-2H-四氮唑單鈉鹽（WST-8）添加到各孔中，再孵育1 h。通過酶標(biāo)儀對所有孔的吸光度（OD）值進行測量，從而計算細胞活性。細胞活性=（實驗組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）×100%。

1.6 蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）檢測 將各組細胞置于冰上，加入4℃的預(yù)冷RIPA細胞蛋白裂解液，提取細胞全蛋白，蛋白濃度定量檢測采用二喹啉甲酸（BCA）法。蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳（電壓：濃縮膠200 V，分離膠100 V；時間約90 min）后，進行半干轉(zhuǎn)膜[時間：（蛋白分子量+5）min，電壓 40 V]。隨后加入 5%的脫脂奶粉-TBST封閉液于室溫封閉2 h，再分別加入按1∶1 000比例稀釋的 PEDF、PI3K、p-Akt、Akt、c-Met和 β-actin 一抗，4 ℃輕搖過夜；第2天加入相應(yīng)二抗（1∶100比例稀釋），在37℃恒溫下?lián)u床避光孵育2 h。最終蛋白的相對表達量用待測蛋白灰度值/β-actin灰度值計算得出。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。定量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用兩樣本均數(shù)的t檢驗，3組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；定性資料采用例數(shù)（百分比）表示，組間比較采用卡方檢驗。所有檢驗均以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 癌旁組織和宮頸癌組織樣本中蛋白表達水平及評分 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：癌旁組織樣本中的PEDF蛋白多為棕褐色，呈強陽或中陽性（7～9分）；PI3K和磷酸化Akt（p-Akt）蛋白多為淺黃色，均為弱陽性（2～3分和2～5分），見圖1（見封三）。而在宮頸癌組織切片中PEDF蛋白著色明顯變淡，多為棕黃色，呈弱陽性或中陽性（4～7分），這說明在宮頸癌組織中PEDF蛋白的表達降低；而PI3K和p-Akt蛋白均顯濃棕褐色，為強陽或中陽性（8～9分），表明宮頸癌組織中的PI3K/Akt信號通路被顯著激活。

圖2 HCerEpiC、HeLa、HeLa+PEDF細胞中PEDF、PI3K、p-Akt和c-Met的蛋白表達情況

2.2 PEDF抑制HeLa細胞中PI3K/Akt通路并降低細胞活性和侵襲相關(guān)蛋白表達 通過Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)，在人正常宮頸上皮HCerEpiC細胞中的PEDF表達較高，而在人宮頸癌HeLa細胞中PEDF水平顯著降低（P＜0.01），見圖 2。此外，HeLa細胞中的PI3K/Akt信號通路較HCerEpiC細胞顯著激活（P＜0.01）。HeLa細胞中的 c-Met表達較HCerEpiC細胞顯著增加（P＜0.01）。使用10 nmol/L PEDF處理HeLa細胞后，細胞內(nèi)的PI3K、p-Akt和c-Met蛋白的表達均顯著降低（P＜0.01）。而且HeLa細胞的活性經(jīng)PEDF處理也被顯著抑制（P＜0.01），見表1。

2.3 PEDF通過PI3K/Akt雙重抑制作用降低HeLa細胞的活性和侵襲相關(guān)蛋白水平 在HeLa+PEDF組中添加PI3K激活劑740 Y-P并無法使下游的p-Akt表達增加，且c-Met蛋白水平和細胞活性也沒有增加。而當(dāng)使用Akt激活劑IGF-1時，HeLa細胞內(nèi)的c-Met蛋白水平和細胞活性較Hela+PEDF組均有顯著提升（P＜0.01）。見圖3和表2。

2.4 PEDF的抗腫瘤作用機制并不限于PI3K/Akt通路的抑制 使用PI3K抑制劑LY294002和Akt抑制劑GSK690693來對比PEDF對PI3K/Akt通路的抑制作用，結(jié)果表明LY294002和GSK690693對PI3K/Akt通路的抑制程度與PEDF的抑制作用相當(dāng)。然而，LY294002和GSK690693對HeLa細胞活性和侵襲相關(guān)蛋白水平的抑制作用不如PEDF明顯（P＜0.01）。見圖4和表3。

表1 HCerEpiC、HeLa、HeLa+PEDF 細胞中蛋白表達水平及細胞活性比較（±s，n=10）

表1 HCerEpiC、HeLa、HeLa+PEDF 細胞中蛋白表達水平及細胞活性比較（±s，n=10）

注：**與 HCerEpiC 細胞組比較，P＜0.01，##與 HeLa細胞組比較，P＜0.01。

組別 PEDF PI3K p-Akt Akt c-Met 細胞活性（%）HCerEpiC 82.34±8.61 16.84±2.11 11.21±1.93 71.30±3.32 9.88±6.77 96.75±3.44 HeLa 14.36±3.52** 71.43±3.35** 68.93±2.03** 13.34±3.97** 64.54±7.69** 98.88±2.57 HeLa+PEDF 79.37±6.35 13.90±2.88## 10.89±2.82## 65.32±3.02## 9.12±5.42## 36.77±8.92##F 425.2 1 614.0 1 949.0 1 202.0 187.5 344.1 P＜0.000 1 ＜0.000 1 ＜0.000 1 ＜0.000 1 ＜0.000 1 ＜0.000 1

圖3 HeLa細胞經(jīng)PEDF、PI3K激活劑或Akt激活劑處理后蛋白表達水平變化

表2 HeLa+PEDF、HeLa+PEDF+740Y-P、HeLa+PEDF+IGF-1細胞中蛋白的水平變化及細胞活性變化 （±s，n=10）

表2 HeLa+PEDF、HeLa+PEDF+740Y-P、HeLa+PEDF+IGF-1細胞中蛋白的水平變化及細胞活性變化 （±s，n=10）

注：**與HeLa+PEDF細胞組比較，P＜0.01。

組別 PI3K p-Akt Akt c-Met 細胞活性（%）HeLa+PEDF 13.54±2.42 13.24±2.12 73.36±4.32 9.23±3.02 34.73±7.77 HeLa+PEDF+740 Y-P 84.03±3.12** 12.39±2.43 71.28±3.61 9.67±2.71 31.12±6.63 HeLa+PEDF+IGF-1 12.45±3.03 59.45±1.99** 9.60±4.12** 82.12±6.29** 74.28±6.08**F 2 980.0 1 732.0 799.4 1 151.0 171.3 P＜0.000 1 ＜0.000 1 ＜0.000 1 ＜0.000 1 ＜0.000 1

圖4 HeLa細胞經(jīng)PEDF或PI3K/Akt抑制劑處理后蛋白的表達情況

表3 HeLa+PEDF、HeLa+LY294002+GSK690693細胞中蛋白水平及細胞活性的對比（±s，n=10）

表3 HeLa+PEDF、HeLa+LY294002+GSK690693細胞中蛋白水平及細胞活性的對比（±s，n=10）

組別 PI3K p-Akt Akt c-Met 細胞活性（%）HeLa+PEDF 11.28±2.01 14.11±2.61 74.62±5.12 10.03±2.69 31.19±5.28 HeLa+LY294002+GSK690693 10.08±3.38 13.27±3.06 78.96±4.31 28.72±3.10 59.31±8.27 t 0.96 0.66 2.05 14.41 9.06 P 0.348 0 0.517 4 0.055 4 ＜0.000 1 ＜0.000 1

3 討論

在全球女性惡性腫瘤中，宮頸癌的發(fā)病率僅次于乳腺癌和結(jié)直腸癌，而在發(fā)展中國家婦女中其發(fā)病率則在惡性腫瘤中排第一位[11]。目前宮頸癌的治療主要是手術(shù)、放療和（或）放療，但晚期宮頸癌對化療不敏感且已失去手術(shù)意義。傳統(tǒng)的化療藥物在延長宮頸癌患者生存期和提高生活質(zhì)量方面的效果不佳且不良反應(yīng)嚴(yán)重[12]，所以近年來探索針對宮頸癌信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的靶向藥物已成為研究熱點。PI3K作為RAS信號通路的下調(diào)因子，是一種常見的受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)脂類激酶[13]。PI3K激活后可將膜脂磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸鹽（Ptd Ins[4，5]P2）轉(zhuǎn)化成磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸鹽（Ptd Ins[3，4，5]P3），Akt和磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1（PDK1）又通過直接與Ptd Ins[3，4，5]P3結(jié)合而被募集到 PI3K 活性位點[14]，且PDK1與Ptd Ins[3，4，5]P3結(jié)合促進了Akt的磷酸化[15]，導(dǎo)致其下游蛋白的磷酸化，從而發(fā)揮一系列下游效應(yīng)。PI3K/Akt信號通路與宮頸癌的相關(guān)研究一直以來都備受關(guān)注。有研究發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路參與人宮頸癌細胞的增殖、分化以及凋亡的調(diào)節(jié)[16]；而PI3K/Akt/核因子κB（NF-κB）信號通路對宮頸癌HeLa細胞的遷移和侵襲起重要作用[17]。

由于宮頸癌細胞中有顯著的PI3K/Akt通路激活現(xiàn)象，使PI3K/Akt抑制劑用于治療宮頸癌成為可能。常見的PI3K抑制劑有wotrmannin、槲皮素、LY294002和吲哚-3-甲醇等，而Akt抑制劑主要有GSK 690693、MK-2206、SC-66和木黃酮。最近有研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/mTOR雙重抑制劑BEZ235可有效地阻斷HeLa細胞中PI3K和mTOR的活化，并以時間和濃度相關(guān)的方式抑制細胞生長，最終導(dǎo)致細胞停滯在G1期并發(fā)生凋亡[18]。PI3K/mTOR的雙重抑制劑有較多好處，其在抑制PI3K激酶的同時又能作用于非PI3K依賴的靶點mTOR上，且可以避免產(chǎn)生負(fù)反饋環(huán)路導(dǎo)致mTOR抑制劑效果不佳[19]。

PEDF具有顯著地抑制血管內(nèi)皮增殖、遷移和促進凋亡作用[20]。近年來，PEDF的抗新生血管生成作用在抗腫瘤方面的研究也逐漸被重視。研究表明，PEDF可導(dǎo)致腫瘤組織內(nèi)的血管生成減少，從而促進腫瘤細胞凋亡和分化；此外，PEDF可直接針對腫瘤組織的血管抑制而并不影響周圍健康組織的血管新生[21]。PEDF可使宮頸癌組織中微血管密度和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達顯著下降，說明PEDF抑制宮頸癌組織生長的作用有一部分是通過下調(diào)VEGF 實現(xiàn)的[22]。

本研究發(fā)現(xiàn)了PEDF在宮頸癌方面新作用，即雙重抑制PI3K/Akt通路從而下調(diào)HeLa細胞的活性和侵襲相關(guān)蛋白表達。本研究表明PEDF不但能抑制PI3K的活性，且在PEDF存在的情況下加入PI3K激活劑并不能激活下游Akt的活性，這說明PEDF對Akt的活性也有抑制作用。據(jù)報道，PEDF在有些組織中可激活PI3K/Akt通路繼而發(fā)揮下游效應(yīng)[23]。推測這可能是PEDF的組織特異性導(dǎo)致PEDF在不同組織中對PI3K/Akt產(chǎn)生不同的作用。此外，本研究對PEDF與PI3K/Akt抑制劑進行比較發(fā)現(xiàn)，PEDF對HeLa的細胞活性和侵襲相關(guān)蛋白表達的影響大于PI3K/Akt抑制劑。這說明PEDF的抗腫瘤效果可能更優(yōu)于單純的PI3K/Akt抑制劑，而造成這一現(xiàn)象的可能原因是PEDF的抗新生血管作用，但PEDF是否還有別的抗腫瘤機制仍有待于進一步研究。

綜上所述，本研究揭示了PEDF抑制了宮頸癌HeLa細胞中PI3K/Akt通路的激活，進而調(diào)節(jié)HeLa細胞的活性和侵襲相關(guān)蛋白水平。本研究所發(fā)現(xiàn)的PI3K/Akt通路抑制現(xiàn)象拓寬了PEDF在抗腫瘤方面的機制和運用，為宮頸癌的防治策略提供了有益的理論依據(jù)。