miR-210和HIF-1α在子癇前期患者胎盤中的表達(dá)關(guān)系研究

陳敏，王明珠，劉增佑

子癇前期（pre-eclampsia，PE）是一種全身多系統(tǒng)不適的妊娠期特異性疾病，臨床表現(xiàn)為妊娠20周以后出現(xiàn)尿蛋白、高血壓、內(nèi)皮細(xì)胞功能異常、異常血管反應(yīng)等功能紊亂，嚴(yán)重者可導(dǎo)致孕婦及胎兒死亡[1]。目前PE發(fā)病機(jī)制尚不明了，研究表明子宮螺旋動(dòng)脈重鑄不良、胎盤滋養(yǎng)層和靶器官內(nèi)皮功能障礙、系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)等與PE發(fā)病關(guān)系密切[2]。miR-210是一種微小RNA（microRNA，miRNA），在 PE 患者胎盤中異常表達(dá)[3]。缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）是調(diào)節(jié)PE患者胎盤缺氧代謝平衡的重要轉(zhuǎn)錄因子，研究表明HIF-1α在PE患者胎盤中表達(dá)水平顯著升高[4-5]。本研究通過檢測(cè)研究對(duì)象胎盤中miR-210和HIF-1α表達(dá)水平及血壓、尿蛋白等臨床生化指標(biāo)，分析miR-210和HIF-1α在PE患者胎盤中表達(dá)的相關(guān)性及對(duì)PE發(fā)病的影響。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取深圳市南山區(qū)人民醫(yī)院（我院）2016年1月—2018年2月收治的46例PE孕婦為研究對(duì)象，根據(jù)國(guó)際診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]分組，輕度子癇前期患者21例設(shè)為輕度組、重度子癇前期患者25例設(shè)為重度組。另取同期在我院孕檢正常并在妊娠結(jié)束行剖宮產(chǎn)的孕婦34例為對(duì)照組，年齡23～30歲，平均（26.87±5.19）歲，孕周 31～41 周，平均（36.45±4.08）周。3組研究對(duì)象在年齡、孕周及體質(zhì)量指數(shù)（BMI）等基本資料方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性（P＞0.05），詳見表1。納入標(biāo)準(zhǔn)：①以剖宮產(chǎn)終止妊娠患者；②單胎、初產(chǎn)孕婦；③同意配合研究，簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他產(chǎn)科并發(fā)癥及其他內(nèi)科合并癥患者；②心臟病、高血壓及家族遺傳病史患者；③自然陰道分娩患者；④有血液性疾病病史患者；⑤胎盤早剝、胎兒宮內(nèi)窘迫、發(fā)育遲緩患者。

表1 3組基本資料比較（±s）

表1 3組基本資料比較（±s）

組別n年齡（歲）孕周（周）BMI（kg/m2）對(duì)照組 34 26.87±5.19 36.45±4.08 27.54±5.79輕度組 21 26.96±5.28 37.51±3.62 27.31±5.63重度組 25 27.48±5.92 36.85±3.86 27.88±6.11 F 0.098 0.481 0.056 P 0.907 0.621 0.946

1.2 研究方法

1.2.1 胎盤中miR-210、HIF-1α mRNA表達(dá)水平測(cè)定 孕婦進(jìn)行剖宮產(chǎn)時(shí)，胎盤娩出30 min內(nèi)取胎盤絨毛膜組織，用0.9%氯化鈉沖洗干凈并吸干表面水分，置于-80℃保存?zhèn)溆?。行胎盤總RNA提取，然后按照Thermo Fisher公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟合成互補(bǔ)脫氧核糖核酸（complementary DNA，cDNA），miR-210以 U6為內(nèi)參，HIF-1α 以 β-actin為內(nèi)參進(jìn)行定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR），條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，60℃退火45 s，64℃延伸15 s，共進(jìn)行40個(gè)反應(yīng)循環(huán)。引物序列見表2。

表2 定量PCR引物序列

1.2.2 胎盤中HIF-1α表達(dá)測(cè)定 孕婦進(jìn)行剖宮產(chǎn)時(shí)，胎盤娩出30 min內(nèi)取胎盤母體面中央組織，大小約為1 cm×1 cm×1 cm，經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋后，進(jìn)行4 μm切片處理，采用免疫組織化學(xué)染色法（SP），按照染色步驟進(jìn)行。

結(jié)果判定：每個(gè)切片至少選擇10個(gè)高倍視野，當(dāng)在顯微鏡下觀察到細(xì)胞核中或胞質(zhì)內(nèi)可見較為清晰的棕黃色顆粒時(shí)判定為陽(yáng)性。染色強(qiáng)度計(jì)分：細(xì)胞核或胞漿中有大量棕色或褐色顆粒沉著計(jì)3分，有較多棕黃色顆粒沉著計(jì)2分，少量淡黃色顆粒沉著計(jì)1分，未染色計(jì)0分；單位視野范圍內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比計(jì)分：＞80%計(jì)4分，60%～80%計(jì)3分，40%～60%計(jì)2分，20%～40%計(jì)1分，＜20%計(jì)0分。染色強(qiáng)度為兩者積分乘積：0分為陰性（-），1～4分為弱陽(yáng)性（+），5～8分為中等陽(yáng)性（++），9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。陰性和弱陽(yáng)性為HIF-1α低表達(dá)，中等陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性為HIF-1α高表達(dá)。

1.2.3 常規(guī)指標(biāo)檢測(cè) 測(cè)定研究對(duì)象的BMI、收縮壓（systolic blood pressure，SBP）、舒張壓（diastolic blood pressure，DBP）和尿蛋白（protein，PRO）情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。定性資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；定量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t或SNK-q檢驗(yàn)；采用Pearson法分析miR-210與HIF-1α在PE患者胎盤組織中表達(dá)相關(guān)性；受試者工作特征（ROC）曲線分析miR-210與HIF-1α對(duì)PE的診斷價(jià)值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PE患者臨床指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果分析 3組SBP、DBP、PRO比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其中重度組患者SBP、DBP、PRO水平高于輕度組和對(duì)照組（P＜0.05），輕度組患者 SBP、DBP、PRO 水平高于對(duì)照組（P＜0.05）。見表 3。

表3 生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果分析比較（±s）

表3 生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果分析比較（±s）

注：#與對(duì)照組相比，P＜0.05；*與輕度組相比，P＜0.05。1 mmHg=0.133 kPa。

組別 n SBP（mmHg） DBP（mmHg） PRO（g/L）對(duì)照組 34 125.05±33.24 80.03±11.22 0.16±0.03輕度組 21 149.36±33.61# 94.72±17.48# 1.09±0.38#重度組 25 162.28±39.75#* 113.86±21.89#* 1.11±0.47#*F 8.376 29.169 81.086 P 0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.2 胎盤中miR-210、HIF-1α mRNA相對(duì)表達(dá)量3組患者miR-210、HIF-1α mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，輕度組患者胎盤中miR-210、HIF-1α mRNA相對(duì)表達(dá)量升高（P＜0.05）；與對(duì)照組、輕度組相比，重度組PE患者胎盤中miR-210、HIF-1α mRNA相對(duì)表達(dá)量升高（P＜0.05）。見表 4。

表4 胎盤中miR-210、HIF-1α mRNA相對(duì)表達(dá)量（±s）

表4 胎盤中miR-210、HIF-1α mRNA相對(duì)表達(dá)量（±s）

注：#與對(duì)照組相比，P＜0.05；*與輕度組相比，P＜0.05。

組別 n miR-210 HIF-1α mRNA對(duì)照組 34 0.73±0.22 1.01±0.13輕度組 21 1.64±0.31# 1.72±0.35#重度組 25 2.21±0.76#* 2.30±0.59#*F 72.643 82.637 P＜0.001 ＜0.001

2.3 胎盤中HIF-1α表達(dá) 胎盤組織中HIF-1α在胎盤組織中呈陽(yáng)性表達(dá)，染色呈黃色、棕褐色、褐色，見圖1（見后插二）。3組HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=26.190，P=0.000），重度組 PE 患者胎盤組織中HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)率高于輕度組和對(duì)照組（χ2分別為 4.061 和 25.555，P＜0.05），輕度組患者胎盤組織中HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)率高于對(duì)照組（χ2=9.198，P＜0.05），見表 5。

表5 胎盤中HIF-1α表達(dá)[n（%）]

2.4 胎盤中miR-210和HIF-1α表達(dá)與PE患者臨床指標(biāo)的關(guān)系 胎盤中miR-210和HIF-1α表達(dá)與PE患者年齡、孕周和BMI無(wú)關(guān)（P＞0.05），與SBP、DBP、PRO水平和 PE嚴(yán)重程度有關(guān)（P＜0.05），見表6。

表6 胎盤中miR-210和HIF-1α表達(dá)與PE患者臨床指標(biāo)的關(guān)系

2.5 PE患者胎盤中miR-210和HIF-1α表達(dá)的相關(guān)性 經(jīng)Pearson法分析顯示，PE患者胎盤中miR-210與 HIF-1α 表達(dá)呈正相關(guān)（n=46，r=0.892，t=13.09，P＜0.05），見圖 2。

圖2 PE患者胎盤中miR-210和HIF-1α表達(dá)的相關(guān)性分析

2.6 ROC分析miR-210、HIF-1α表達(dá)水平對(duì)PE的診斷價(jià)值 結(jié)果顯示，miR-210的ROC曲線下面積（AUC）為 0.726，95%CI為 0.615～0.820，敏感度為80.43%，特異度為70.59%，截?cái)嘀禐?.06；HIF-1α的 AUC為0.769，95%CI為 0.661～0.856，敏感度為78.26%，特異度為82.35%，截?cái)嘀禐?.27，見圖3（見后插二）。

3 討論

PE是由遺傳代謝、免疫反應(yīng)及氧化應(yīng)激等多種因素引起的功能性疾病，病因復(fù)雜，發(fā)病率高，可導(dǎo)致患者出現(xiàn)血管痙攣、臟器供血不足、胎盤組織缺氧等癥狀，引起胎兒發(fā)育不良，甚至死亡。胎盤是胎兒與母體發(fā)生營(yíng)養(yǎng)交換的場(chǎng)所，妊娠早期絨毛膜外滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖、分化并入侵母體子宮肌層螺旋動(dòng)脈壁，啟動(dòng)血管重鑄，形成循環(huán)脈管系統(tǒng)，建立物質(zhì)交換場(chǎng)所，滿足胎兒對(duì)血液及氧氣等物質(zhì)需求[7]。胎盤缺血缺氧可導(dǎo)致絨毛膜外滋養(yǎng)層細(xì)胞入侵較淺，血管重鑄出現(xiàn)障礙，影響胎盤功能。近年研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α可調(diào)控滋養(yǎng)層細(xì)胞低氧適應(yīng)性變化，參與PE低氧反應(yīng)基因表達(dá)調(diào)節(jié)[8]。在HIF-1α信號(hào)通路中，miR-210可通過互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合到HIF-1α的3′非翻譯區(qū)，進(jìn)而調(diào)控HIF-1α翻譯，HIF-1ɑ能夠與miR-210轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)處低氧反應(yīng)元件結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控miR-210表達(dá)[9]。本研究通過對(duì)PE患者胎盤中miR-210和HIF-1α表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，分析miR-210和HIF-1α在PE患者胎盤中表達(dá)相關(guān)性及與PE患者臨床病理的關(guān)系，為提高臨床診療效果提供參考。

MiRNA可與靶mRNA發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)，影響其翻譯，促使靶基因降解，調(diào)控基因表達(dá)，參與細(xì)胞增殖、分化、遷移和凋亡等生命過程[10]。研究表明，PE患者胎盤中含有大量異常表達(dá)的miRNA，其中以低氧標(biāo)志miR-210最為顯著，miR-210可通過靶基因調(diào)控細(xì)胞代謝、DNA修復(fù)、血管生成過程[11]。胎盤組織中miR-210在缺氧環(huán)境下可抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖、分化及遷移，限制細(xì)胞新陳代謝，影響胎盤中線粒體呼吸作用，參與PE發(fā)生、發(fā)展[12]。焦秋香等[13]研究表明，miR-210在重度PE患者血清和胎盤組織中呈異常表達(dá)，因此認(rèn)為miR-210的異常表達(dá)可通過調(diào)控其靶基因參與PE患者病理生理過程。本研究結(jié)果表明，隨著PE患者嚴(yán)重程度的增加，miR-210相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，且明顯高于對(duì)照組，本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果基本一致，提示miR-210相對(duì)表達(dá)量隨胎盤缺氧程度的增加而升高，由此推測(cè)miR-210可能作為PE患者胎盤缺氧的分子標(biāo)記物參與PE疾病發(fā)生、發(fā)展，但是由于本研究?jī)H研究miR-210在胎盤組織中的表達(dá)情況，并未研究其在血清中表達(dá)情況，因此還有待從不同角度探討miR-210與PE的關(guān)系。

HIF-1α作為缺氧調(diào)節(jié)通路中關(guān)鍵環(huán)節(jié)，最早由Semenza[14]作為連接在基因缺氧反應(yīng)元件上的核因子而發(fā)現(xiàn)，是細(xì)胞在應(yīng)激缺氧環(huán)境下產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄激活因子。胎盤組織缺氧可誘導(dǎo)HIF-1α高表達(dá)，與細(xì)胞質(zhì)中穩(wěn)定表達(dá)的HIF-1β結(jié)合形成二聚體，維持胎盤內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，改善胎盤組織缺氧耐受以適應(yīng)低氧變化[15-16]。陳光雪等[17]研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α在妊娠期高血壓疾病中高表達(dá)，與妊娠期高血壓疾病發(fā)生有密切關(guān)系。本研究結(jié)果顯示，PE患者胎盤組織中HIF-1α水平顯著高于對(duì)照組，且隨著PE患者疾病嚴(yán)重程度的增加，HIF-1α水平呈上升趨勢(shì)，推測(cè)胎盤中HIF-1α表達(dá)異?？赡芘cPE疾病發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。Duette等[18]研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α也可以調(diào)控細(xì)胞因子分泌，影響滋養(yǎng)細(xì)胞功能，如刺激胎盤生長(zhǎng)因子分泌，加重血管內(nèi)皮損傷并妨礙其再修復(fù)過程，引起胎盤血管重鑄障礙，加劇PE進(jìn)展。但是由于本研究不深入，關(guān)于HIF-1α在PE發(fā)生、發(fā)展中具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果還顯示，胎盤中miR-210和HIF-1α表達(dá)與PE患者年齡、孕周和BMI無(wú)關(guān)，與SBP、DBP、PRO水平和PE嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，說(shuō)明隨著PE患者SBP、DBP和PRO水平升高，胎盤中miR-210和HIF-1α表達(dá)均明顯升高，且隨著PE嚴(yán)重程度的加重，miR-210和HIF-1α表達(dá)水平隨之升高，提示PE患者胎盤組織中miR-210和HIF-1α表達(dá)與PE疾病發(fā)展有關(guān)。本研究還顯示，PE患者胎盤中miR-210和HIF-1α表達(dá)水平呈正相關(guān)，分析原因可能為二者通過某種機(jī)制共同參與PE疾病發(fā)展。Merlo等[19]研究顯示，miR-210是缺氧誘導(dǎo)因子明確的目標(biāo)，HIF-1α蛋白能夠通過miR-210途徑參與調(diào)控細(xì)胞代謝過程及其基因表達(dá)。Korkes等[9]研究子癇前期和非高血壓患者HIF-1α、可溶性血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體1（sFlt-1）與miR-210的關(guān)系中顯示，sFlt-1與miR-210呈正相關(guān)，但是HIF-1α與miR-210無(wú)顯著相關(guān)性，此結(jié)果與本研究結(jié)果不同，分析可能是由于本研究納入樣本量較少以及地區(qū)不同而造成的。關(guān)于PE患者胎盤中二者的相互作用機(jī)制尚不明確，還有待深入分析。最后，本研結(jié)果顯示miR-210、HIF-1α表達(dá)水平均對(duì)PE具有較高的敏感度及特異度，提示miR-210和HIF-1α可能作為臨床診斷及治療PE的潛在分子標(biāo)記物。

綜上，miR-210和HIF-1α在PE患者胎盤組織中高表達(dá)，二者表達(dá)水平呈正相關(guān)，與患者SBP、DBP、PRO水平及PE嚴(yán)重程度有關(guān)，推測(cè)miR-210和HIF-1α可能參與PE疾病發(fā)生、發(fā)展。通過檢測(cè)PE患者miR-210和HIF-1α表達(dá)水平有助于臨床早期診斷，并可為PE治療方案的制定提供參考。但關(guān)于miR-210和HIF-1α在PE發(fā)生及發(fā)展過程中的具體作用機(jī)制有待深入研究。