玉米ZmcpSRP54基因可變剪接分析

關(guān)海英 何春梅 王娟 劉鐵山 董瑞 劉春曉 劉強(qiáng) 汪黎明

摘要：cpSRP54基因在植物葉綠體發(fā)育中發(fā)揮重要作用。本研究用生物信息學(xué)方法對(duì)玉米ZmcpSRP54蛋白進(jìn)行了進(jìn)化分析，利用RT-PCR方法對(duì)玉米ZmcpSRP54基因全長(zhǎng)cDNA進(jìn)行了克隆，進(jìn)而對(duì)其進(jìn)行可變剪接分析。結(jié)果表明，玉米ZmcpSRP54蛋白與其它7個(gè)物種的cpSRP54蛋白有很高的相似性。鑒定到玉米ZmcpSRP54基因25個(gè)不同轉(zhuǎn)錄本，1個(gè)為標(biāo)準(zhǔn)剪接轉(zhuǎn)錄本，其它24個(gè)為可變剪接轉(zhuǎn)錄本。24個(gè)可變剪接轉(zhuǎn)錄本共使用了17種非標(biāo)準(zhǔn)剪接位點(diǎn)，4種可變剪接方式，主要以可變的3′端位點(diǎn)、可變的5′端位點(diǎn)和外顯子跳躍3種可變剪接方式為主。預(yù)測(cè)出18種不同長(zhǎng)度的ORF，編碼18種不同長(zhǎng)度的多肽。11個(gè)多肽其保守結(jié)構(gòu)域氨基酸序列發(fā)生部分缺失，6個(gè)多肽其保守結(jié)構(gòu)域氨基酸序列發(fā)生全部缺失，1個(gè)編碼全新的多肽。這些結(jié)果將為玉米ZmcpSRP54基因的功能研究提供重要信息。

關(guān)鍵詞：玉米;ZmcpSRP54基因;RT-PCR;可變剪接???? 中圖分類(lèi)號(hào)：S513：Q781??文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A??文章編號(hào)：1001-4942（2019）06-0001-10

Abstract?The cpSRP54 gene plays an important role during chloroplast development in plant. In this study， the bioinformatics method was used for the evolutionary analysis of maize ZmcpSRP54 protein， the RT-PCR method was used for the cloning of full-length cDNA of maize ZmcpSRP54 gene， and then the bioinformatics methods were used for the analysis of alternative splicing. Phylogenetic analysis revealed that the maize ZmcpSRP54 protein was conserved with those cpSRP54 proteins in the other seven species. A total of 25 different transcripts of ZmcpSRP54 were obtained， and 1 was a standard splicing transcript and the other 24 were alternative splicing （AS） transcripts. A total of 17 non-standard splice sites and 4 AS forms were used for the 24 AS transcripts， and alternative 3′ splice site， alternative 5′ splice site and exon skipping were the most prevalent AS forms. A total of 18 ORFs with different lengths were predicted for these 24 AS transcripts， encoding 18 polypeptides with different lengths， and 11 of which had part of the amino acid sequences in the conserved region deleted， 6 of which had all of the amino acid sequences in the conserved region deleted， while 1 of which encoded another new polypeptide. These results would provide important information for the functional study of the ZmcpSRP54 gene in maize.

Keywords?Maize; ZmcpSRP54 gene; RT-PCR; Alternative splicing

cpSRP54（chloroplast signal recognition particle 54）是cpSRP（cpSRP54，cpSRP43，cpFtsY和ALB3）途徑的重要成員之一，在葉綠體發(fā)育中發(fā)揮重要作用，該蛋白與其它3個(gè)成員相互作用將捕光葉綠素蛋白（LHCPS）從葉綠體基質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)囊體膜上[1，2]。擬南芥和水稻中的cpSRP54基因突變后其葉綠體發(fā)育均受阻，葉片葉綠素含量顯著下降導(dǎo)致植株葉片顏色呈現(xiàn)淺綠色[3-5]。其中水稻ygl14（t）突變體是由于第1個(gè)內(nèi)含子與第2個(gè)外顯子交界處的第2個(gè)堿基A變?yōu)門(mén)，導(dǎo)致OscpSRP54第一內(nèi)含子保留，造成氨基酸錯(cuò)譯而引起植株葉片顏色發(fā)生變異[3]。

可變剪接（alternative splicing，AS）是指一個(gè)前體mRNA選擇不同的剪接方式（通過(guò)不同的內(nèi)含子剪切和外顯子連接方式）產(chǎn)生多種mRNA結(jié)構(gòu)的過(guò)程[6]?？勺兗艚邮且环N關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制，能使一個(gè)基因產(chǎn)生多個(gè)轉(zhuǎn)錄本和蛋白異構(gòu)體，豐富了蛋白質(zhì)的多樣性，也增加了其功能的復(fù)雜性[6-8]。前人研究表明，人體基因中約有95%以上都存在可變剪接[9]。1989年，在擬南芥和菠菜中發(fā)現(xiàn)1， 5-二磷酸核酮糖羧化加氧酶活化酶（rubsicoactivase）基因發(fā)生可變剪接[10]。后經(jīng)過(guò)20多年的研究發(fā)現(xiàn)，可變剪接是調(diào)控植物基因表達(dá)的重要方式[11]，參與植物的很多生理代謝過(guò)程、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及對(duì)外界生物和非生物脅迫的響應(yīng)[12-17]。植物基因中大約60%都存在可變剪接[12]?？勺兗艚臃绞街饕ㄍ怙@子跳躍（exon skipping，ES）、內(nèi)含子保留（intron retention，IR）、可變的5′端位點(diǎn)（alternative 5′splice site，A5SS）、可變的3′端位點(diǎn)（alternative 3′ splice site，A3SS）、互斥外顯子（mutually exclusive exon，MEX）等5種基本剪接方式[18]。植物中最多的剪接方式是內(nèi)含子保留[19-22]。

用水稻OscpSRP54基因序列在玉米中進(jìn)行同源比對(duì)發(fā)現(xiàn)玉米ZmcpSRP54基因位于10號(hào)染色體上，DNA全長(zhǎng)7 526 bp（GRMZM2G113093，B73_RefGen_v3，http：//www.maizegdb.org）。該基因有4個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄本（GRMZM2G113093_T01和GRMZM2G113093_T02，B73_RefGen_v3;Zm00001d023431_T001和Zm00001d023431_T002，B73_RefGen_v4，http：//ensembl.gramene.org/Zea_mays/Info/Index），其中3個(gè)轉(zhuǎn)錄本（GRMZM2G113093_T01、Zm00001d023431_T001和Zm00001d023431_T002）包括15個(gè)外顯子和14個(gè)內(nèi)含子，1個(gè)轉(zhuǎn)錄本（GRMZM2G113093_T02）包括10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子。4個(gè)轉(zhuǎn)錄本編碼3種不同長(zhǎng)度的多肽，分別包含556（GRMZM2G113093_T01和Zm00001d023431_T001）、351（GRMZM2G113093_T02）和564（Zm00001d023431_T002）個(gè)氨基酸。為了進(jìn)一步研究該基因是否還有其它可變剪接轉(zhuǎn)錄本，本研究通過(guò)RT-PCR方法對(duì)ZmcpSRP54基因全長(zhǎng)cDNA進(jìn)行克隆，并利用生物信息學(xué)軟件探索其可變剪接方式，以期為進(jìn)一步研究玉米及其它物種中該基因的可變剪接機(jī)制以及深入研究該基因的功能提供參考依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料 ? ?試驗(yàn)所用材料是玉米自交系B73，種植于山東章丘龍山基地。開(kāi)花期取穗位葉，快速置于液氮中速凍，置-80℃冰箱貯存，用于后續(xù)RNA提取。

1.2?多序列比對(duì)及進(jìn)化分析 ? 將ZmcpSRP54蛋白序列通過(guò)NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，下載其他物種的同源蛋白序列。利用DNAMAN 5.2.2軟件進(jìn)行多重氨基酸序列比對(duì)。利用MEGA 7.0.14 軟件對(duì)該基因和其他物種來(lái)源的同源基因進(jìn)行氨基酸序列分析，并利用鄰接法（NL） 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

1.3?RNA提取及第一鏈cDNA獲得 ? ? 將玉米葉片組織用液氮研磨至粉末，取100 mg利用RNA提取試劑盒（TIANGEN，北京）提取RNA。通過(guò)NanoDrop 2000分光光度計(jì)和1%瓊脂糖電泳檢測(cè)RNA純度和濃度，取約4 μg RNA利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，大連）反轉(zhuǎn)錄獲得第一鏈cDNA。所得第一鏈cDNA稀釋4倍后用于后續(xù)RT-PCR擴(kuò)增。

1.4?RT-PCR擴(kuò)增、測(cè)序與可變剪接分析 ? 利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增ZmcpSRP54基因cDNA全長(zhǎng)引物（F： 5′- CTGCTCCCGTACCTCGTCTC-3′; R： 5′- TCCGAGCCCAAGTCCCTAA-3′）。RT-PCR 反應(yīng)體系（20 μL）： TksGflexTM DNA Polymerase （TAKARA，大連）0.3 μL，正反向引物各0.75 μL，模板2 μL，2×TksGflex Buffer 10 μL，加ddH2O補(bǔ)足體系。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min;95℃變性45 s，60℃退火45 s，72℃延伸2 min，共32 個(gè)循環(huán)，結(jié)束反應(yīng)。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收純化后連接pEASY-Blunt載體（全式金，北京），轉(zhuǎn)化大腸桿菌（Escherichia coli）感受態(tài)細(xì)胞DH5α（全式金，北京），挑取單克隆進(jìn)行PCR陽(yáng)性鑒定。將鑒定的陽(yáng)性單克隆進(jìn)行測(cè)序（英濰捷基，北京），獲得全長(zhǎng)序列。利用Splign（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/splign/splign.cgi）、DNAStar（http：//www.dnastar.com）和BioXM 2.6 軟件（http：//bioxm.software.informer.com/）對(duì)這些序列進(jìn)行比對(duì)、外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)分析、ORF預(yù)測(cè)和編碼氨基酸長(zhǎng)度分析等。

2?結(jié)果與分析2.1?ZmcpSRP54基因進(jìn)化分析

用ZmcpSRP54蛋白序列在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLASTP，搜索高粱、谷子、黍子、水稻、烏拉爾圖小麥、二穗短柄草和擬南芥等物種相應(yīng)蛋白質(zhì)序列，利用DNAMAN 5.2.2和MEGA 7.0.14 軟件進(jìn)行多序列比對(duì)和構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。由圖1可見(jiàn)，玉米ZmcpSRP54蛋白PBK10867結(jié)構(gòu)域（信號(hào)顆粒識(shí)別蛋白）氨基酸序列與其它物種cpSRP54蛋白相應(yīng)氨基酸序列有很高的相似性。由圖2可見(jiàn)，玉米ZmcpSRP54與單子葉植物包括高粱SbcpSRP54、谷子SicpSRP54、黍子PhcpSRP54、水稻OscpSRP54、烏拉爾圖小麥TucpSRP54和二穗短柄草BdcpSRP54聚為一個(gè)分支，雙子葉植物擬南芥AtcpSRP54聚為另一個(gè)分支。與玉米ZmcpSRP54親緣關(guān)系最近的是高粱SbcpSRP54，其次為谷子SicpSRP54，其余親緣關(guān)系由近到遠(yuǎn)依次是黍子PhcpSRP54、水稻OscpSRP54、烏拉爾圖小麥TucpSRP54、二穗短柄草BdcpSRP54和擬南

這些結(jié)果表明cpSRP54蛋白在植物中是保守的。2.2?RT-PCR擴(kuò)增獲得ZmcpSRP54基因25個(gè)轉(zhuǎn)錄本

利用設(shè)計(jì)的擴(kuò)增ZmcpSRP54基因cDNA全長(zhǎng)引物，以玉米自交系B73葉片cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增條帶不單一，有多條亮度強(qiáng)弱不等及片段大小不等的條帶（圖3）。Maizegdb（http：//www.maizegdb.org）和Gramene（http：//ensembl.gramene.org/Zea_mays/Info/Index）網(wǎng)站報(bào)道該基因有4個(gè)轉(zhuǎn)錄本，我們推測(cè)該基因可能有多個(gè)轉(zhuǎn)錄本。將PCR產(chǎn)物回收純化后連接克隆載體，64個(gè)單菌落經(jīng)PCR鑒定后得到61個(gè)陽(yáng)性單克隆，將鑒定的陽(yáng)性單克隆送測(cè)序公司測(cè)序。所得序列經(jīng)生物信息學(xué)軟件分析發(fā)現(xiàn)共有25種不同轉(zhuǎn)錄本（圖3B，表1），分別命名為AS1～AS25，除AS2與GRMZM2G113093_T01相同外，其余24種屬于新轉(zhuǎn)錄本（A1和A3～A25）。9個(gè)克隆所測(cè)序列是AS2轉(zhuǎn)錄本（14.75%，所占比例最高），其又與GRMZM2G113093_T01相同，推測(cè)其為標(biāo)準(zhǔn)剪接方式，其它24個(gè)轉(zhuǎn)錄本（共52個(gè)克?。榉菢?biāo)準(zhǔn)剪接方式。

2.3?ZmcpSRP54基因24個(gè)新轉(zhuǎn)錄本可變剪接分析???? 以AS2轉(zhuǎn)錄本為參照，分析其它24個(gè)轉(zhuǎn)錄本的可變剪接方式，結(jié)果見(jiàn)表2。24個(gè)新轉(zhuǎn)錄本主要有4種可變剪接方式，包括外顯子跳躍、內(nèi)含子保留、可變的5′端位點(diǎn)和可變的3′端位點(diǎn)。1個(gè)轉(zhuǎn)錄本（AS4，3個(gè)可變剪接克?。﹥H使用外顯子跳躍一種可變剪接方式;6個(gè)轉(zhuǎn)錄本（AS3、AS5、AS6、AS7、AS8和AS9，共17個(gè)可變剪接克?。┞?lián)合使用可變的3′端位點(diǎn)和可變的5′端位點(diǎn)兩種可變剪接方式;1個(gè)轉(zhuǎn)錄本（AS24，1個(gè)可變剪接克?。┞?lián)合使用可變的3′端位點(diǎn)和外顯子跳躍兩種可變剪接方式;13個(gè)轉(zhuǎn)錄本（AS11、AS12、AS13、AS14、AS15、AS16、AS17、AS18、AS19、AS21、AS22、AS23和AS25，共27個(gè)可變剪接克?。┞?lián)合使用可變的3′端位點(diǎn)、外顯子跳躍和可變的5′端位點(diǎn)這三種可變剪接方式;1個(gè)轉(zhuǎn)錄本（AS1，1個(gè)可變剪接克隆）聯(lián)合使用可變的3′端位點(diǎn)、可變的5′端位點(diǎn)和內(nèi)含子保留三種可變剪接方式;1個(gè)轉(zhuǎn)錄本（AS20，2個(gè)可變剪接克?。┞?lián)合使用可變的3′端位點(diǎn)、外顯子跳躍和內(nèi)含子保留三種可變剪接方式;1個(gè)轉(zhuǎn)錄本（AS10，1個(gè)可變剪接克?。┞?lián)合使用可變的3′端位點(diǎn)和可變的5′端位點(diǎn)兩種可變剪接方式，同時(shí)其第1外顯子內(nèi)部發(fā)生42 bp的剪切形成一個(gè)新的內(nèi)含子（表1、表2）。本研究鑒定到的24種可變剪接轉(zhuǎn)錄本所使用的4種可變剪接方式中，主要是以可變的3′端位點(diǎn)（23個(gè)可變剪接轉(zhuǎn)錄本AS1、AS3、AS5、AS6、AS7、AS8、AS9、AS10、AS11、AS12、AS13、AS14、AS15、AS16、AS17、AS18、AS19、AS20、AS21、AS22、AS23、AS24和AS25，共49個(gè)可變剪接克隆），可變的5′端位點(diǎn)（21個(gè)可變剪接轉(zhuǎn)錄本AS1、AS3、AS5、AS6、AS7、AS8、AS9、AS10、AS11、AS12、AS13、AS14、AS15、AS16、AS17、AS18、AS19、AS21、AS22、AS23和AS25，共46個(gè)可變剪接克?。┖屯怙@子跳躍（16個(gè)可變剪接轉(zhuǎn)錄本AS4、AS11、AS12、AS13、AS14、AS15、AS16、AS17、AS18、AS19、AS20、AS21、AS22、AS23、AS24和AS25，33個(gè)可變剪接克隆）三種可變剪接方式為主。???? 24個(gè)可變剪接轉(zhuǎn)錄本共使用了17種非標(biāo)準(zhǔn)可變剪接位點(diǎn)：①5′-CC..AG-3′（AS1，1個(gè)可變剪接克?。?②5′-CA..AC-3′（AS3、AS7和 AS10，共7個(gè)可變剪接克?。?③5′-CT..AC-3′（AS5，2個(gè)可變剪接克?。?④5′-TA..CT-3′（AS6，4個(gè)可變剪接克?。?⑤5′-CT..AG-3′（AS8和AS19，共7個(gè)可變剪接克?。?⑥5′-GC..GA-3′（AS9，2個(gè)可變剪接克?。?⑦5′-CT..TC-3′（AS10，1個(gè)可變剪接克隆）;⑧5′-CG..AG-3′（AS11，2個(gè)可變剪接克?。?⑨5′-CC..GG-3′（AS12，3個(gè)可變剪接克?。?⑩5′-CC..TT-3′（AS13和AS25，共4個(gè)可變剪接克?。?5′-GC..GG-3′（AS14，3個(gè)可變剪接克?。?5′-GC..TT-3′（AS15和AS17，共5個(gè)可變剪接克?。?5′-CA..AG-3′（AS16和AS22，共2個(gè)可變剪接克?。?5′-TC..AG-3′（AS18，1個(gè)可變剪接克?。?5′-AT..AC-3′（AS20和AS24，共3個(gè)可變剪接克?。?5′-GA..AG-3′（AS21，2個(gè)可變剪接克?。?5′-AC..GG-3′（AS23，1個(gè)可變剪接克隆）。AS10轉(zhuǎn)錄本（1個(gè)可變剪接克隆）使用了兩種非標(biāo)準(zhǔn)可變剪接位點(diǎn)②5′-CA..AC-3′和⑦5′-CT..TC-3′;AS4轉(zhuǎn)錄本（3個(gè)可變剪接克?。┲皇菍⒌?外顯子剪切，未使用非標(biāo)準(zhǔn)剪接位點(diǎn);其它22個(gè)轉(zhuǎn)錄本（共48個(gè)可變剪接克?。┚皇褂靡环N非標(biāo)準(zhǔn)可變剪接位點(diǎn)。???? 從可變剪接發(fā)生的位置與外顯子相關(guān)來(lái)看，與第2外顯子有關(guān)的轉(zhuǎn)錄本最多（全部24個(gè)可變剪接轉(zhuǎn)錄本），8個(gè)轉(zhuǎn)錄本第2外顯子5′端被部分剪切（AS1、AS3、AS5、AS6、AS7、AS8、AS9和AS10，共19個(gè)可變剪接克?。溆?6個(gè)轉(zhuǎn)錄本第2外顯子全部被剪切（共33個(gè)可變剪接克?。?其次是第1外顯子（除AS4外的其余23個(gè)可變剪接轉(zhuǎn)錄本），AS20、AS24和AS25轉(zhuǎn)錄本第1外顯子全部被剪切（共4個(gè)可變剪接克?。?，AS10轉(zhuǎn)錄本第1外顯子內(nèi)部被剪切42 bp形成新內(nèi)含子，其余19個(gè)轉(zhuǎn)錄本第1外顯子3′端被部分剪切（共44個(gè)可變剪接轉(zhuǎn)錄本）;最少的是第15外顯子，只有AS25轉(zhuǎn)錄本第15外顯子5′端被部分剪切。從可變剪接發(fā)生的位置與內(nèi)含子相關(guān)來(lái)看，只有第5內(nèi)含子部分保留（AS1）和第14內(nèi)含子全部保留（AS1和AS20）。

24種可變剪接轉(zhuǎn)錄本預(yù)測(cè)的最長(zhǎng)ORF均比AS2轉(zhuǎn)錄本的ORF短（表2），其長(zhǎng)度短的主要原因有5種：①起始密碼子ATG和終止密碼子TGA位置均未發(fā)生改變，中間區(qū)段被部分剪切（AS6，AS7，AS8，AS13，AS16，AS17和AS21，共18個(gè)可變剪接克?。?②起始密碼子ATG位置未發(fā)生改變，終止密碼子TGA（TAG）向前移動(dòng)（AS18，AS19和AS22，共6個(gè)可變剪接克?。?③起始密碼子ATG向后移動(dòng)，終止密碼子TGA位置未發(fā)生改變（AS3，AS4，AS5，AS9，AS10，AS11，AS12，AS14，AS15，AS23和AS24，共24個(gè)可變剪接克隆）;④起始密碼子ATG向后移動(dòng)，終止密碼子TGA向前移動(dòng)（AS1和AS20，共3個(gè)可變剪接克?。?⑤起始密碼子ATG和終止密碼子TGA均向后移動(dòng)至原來(lái)ORF后，形成全新ORF（AS25，1個(gè)可變剪接克?。?。24種轉(zhuǎn)錄本預(yù)測(cè)的18種不同長(zhǎng)度ORFs預(yù)測(cè)編碼18種長(zhǎng)度不等的多肽，分別包括513（AS6）、512（AS7）、491（AS8）、452（AS3、AS4、AS5、AS9和AS10）、417（AS13）、351（AS12和AS14）、397（AS11）、333（AS1）、230（AS16）、194（AS15）、105（AS17）、62（AS18）、52（AS21）、42（AS24）、38（AS19和AS23）、25（AS22）、24（AS20）、5（AS25）個(gè)氨基酸（圖4）。24種可變剪接轉(zhuǎn)錄本編碼的多肽其保守結(jié)構(gòu)域氨基酸序列發(fā)生部分缺失或完全缺失（圖4）。多肽P-513缺失43個(gè)氨基酸（37～79位），后5個(gè)氨基酸位于保守結(jié)構(gòu)域;多肽P-512缺失44個(gè)氨基酸（38～81位），后7個(gè)氨基酸位于保守結(jié)構(gòu)域;多肽P-491缺失65個(gè)氨基酸（14～78位），后4個(gè)氨基酸位于保守結(jié)構(gòu)域;多肽P-452缺失104個(gè)氨基酸（1～104位），后30個(gè)氨基酸位于保守結(jié)構(gòu)域;多肽P-417缺失139個(gè)氨基酸（58～196位），后122個(gè)氨基酸位于保守結(jié)構(gòu)域;多肽P-397缺失159個(gè)氨基酸（1～159位），后85個(gè)氨基酸位于保守結(jié)構(gòu)域;多肽P-351缺失205個(gè)氨基酸（1～205位），后131個(gè)氨基酸位于保守結(jié)構(gòu)域;多肽P-333缺失223個(gè)氨基酸（1～205位;539～556位），缺失的205個(gè)氨基酸其后131個(gè)氨基酸位于保守結(jié)構(gòu)域，538位氨基酸提前終止;多肽P-230缺失326個(gè)氨基酸（6～331位），后257個(gè)氨基酸位于保守結(jié)構(gòu)域;多肽P-194缺失362個(gè)氨基酸（1～362位），后288個(gè)氨基酸位于保守結(jié)構(gòu)域;多肽P-105缺失451個(gè)氨基酸（15～465位），后391個(gè)氨基酸位于保守結(jié)構(gòu)域;其它6個(gè)多肽（P-62，P-52，P-42，P-38，P-25和P-24）保守結(jié)構(gòu)域氨基酸序列全部缺失;P-5是由于AS25在3′UTR形成短的ORF編碼的全新的多肽。

3?討論與結(jié)論

Maizegdb和Gramene網(wǎng)站報(bào)道ZmcpSRP54基因有4個(gè)轉(zhuǎn)錄本，GRMZM2G113093_T01，GRMZM2G113093_T02，Zm00001d023431_T001和Zm00001d023431_T002。本研究通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增及測(cè)序獲得了ZmcpSRP54基因的25個(gè)轉(zhuǎn)錄本，通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)AS2與GRMZM2G113093_T01相同，沒(méi)有鑒定到GRMZM2G113093_T02，Zm00001d023431_T001和Zm00001d023431_T002這3個(gè)轉(zhuǎn)錄本，可能是這幾個(gè)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量比較低，沒(méi)有被克隆到。植物中可變剪接方式以?xún)?nèi)含子保留為主[19-22]，外顯子跳躍出現(xiàn)的頻率最低[12]。本研究鑒定到的4種可變剪接方式，主要以可變的3′端位點(diǎn)、可變的5′端位點(diǎn)和外顯子跳躍三種可變剪接方式為主，植物中一個(gè)轉(zhuǎn)錄本也會(huì)同時(shí)聯(lián)合使用兩個(gè)及以上可變剪接方式[23]。本研究發(fā)現(xiàn)23個(gè)（24個(gè)可變剪接轉(zhuǎn)錄本中除AS4外）可變剪接轉(zhuǎn)錄本同時(shí)使用兩種及以上可變剪接方式，如果這也是普遍存在的，就會(huì)顯著增加轉(zhuǎn)錄后加工的復(fù)雜性。植物內(nèi)含子序列的識(shí)別位點(diǎn)具有高度保守性，約99.24%的剪接位點(diǎn)符合GT-AG規(guī)則[24]，有的還遵循AT-AC規(guī)則[25]。本研究24個(gè)可變剪接轉(zhuǎn)錄本除了使用GT-AG和AT-AC規(guī)則外，還使用其它16種非標(biāo)準(zhǔn)剪接位點(diǎn)。

本研究鑒定到的25個(gè)轉(zhuǎn)錄本預(yù)測(cè)編碼19個(gè)長(zhǎng)度不同的多肽，除AS2轉(zhuǎn)錄本編碼的多肽P-556與GRMZM2G113093_T01和Zm00001d023431_T001編碼的多肽相同，AS12和AS14轉(zhuǎn)錄本（AS12和AS14轉(zhuǎn)錄本與GRMZM2G113093_T02序列不同）編碼的多肽P-351與GRMZM2G113093_T02編碼的多肽相同，其它17個(gè)為新的多肽。除P-556外的18個(gè)多肽中，11個(gè)多肽其保守結(jié)構(gòu)域氨基酸序列發(fā)生部分缺失， 6個(gè)多肽保守結(jié)構(gòu)域氨基酸序列發(fā)生全部缺失，還有1個(gè)長(zhǎng)度只有5個(gè)氨基酸的全新多肽。保守結(jié)構(gòu)域氨基酸序列發(fā)生部分缺失的11個(gè)多肽是否具有生物學(xué)功能，以及其它6個(gè)保守結(jié)構(gòu)域氨基酸序列發(fā)生全部缺失的多肽及全新多肽P-5是否完全喪失生物學(xué)功能，仍然有待進(jìn)一步研究。本研究發(fā)現(xiàn)的多個(gè)可變剪接體也為進(jìn)一步研究玉米ZmSRP54蛋白功能提供了重要信息。

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