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    雞BCO2基因功能性單核苷酸多態(tài)性的生物 信息分析

    2019-07-08 22:15:19郝文文楊倩倩張貝張健張傳生耿立英李祥龍
    家禽科學 2019年4期
    關(guān)鍵詞:泛素多態(tài)性位點

    郝文文 楊倩倩 張貝 張健 張傳生 耿立英 李祥龍

    摘? 要:旨在篩選雞BCO2基因中具有潛在生物學功能的同義單核苷酸多態(tài)性(non-synonymous single nucleotide polymorphisms,nsSNPs)。從SNP數(shù)據(jù)庫中檢索出8個BCO2 基因nsSNPs,利用SIFT、PolyPhen-2、PANTHER和PROVEAN方法分析引起的氨基酸替換是否可能影響B(tài)CO2 的功能預測。進一步對雞BCO2基因編碼的氨基酸序列進行翻譯后修飾位點預測以及進化位點保守性預測;使用SWISS-MODEL構(gòu)建了BCO2野生型以及突變型蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明:3個nsSNPs(rs739117331、rs735703078和rs736211538)可能嚴重影響B(tài)CO2蛋白功能。

    關(guān)鍵詞:雞;BCO2基因;非同義SNP;SNP功能預測;蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)構(gòu)建中圖分類號:S831? ? ?文獻標識碼:B? ? ?文章編號:1673-1085(2019)04-0017-05

    非同義單核苷酸多態(tài)性(nsSNPs)是指處于編碼區(qū)可引起氨基酸序列變化的單核苷酸突變,因其可能會對蛋白質(zhì)功能造成影響,多被認為是導致畜禽表型變異的重要原因[1,2]。利用生物信息學方法對未知表型的nsSNP進行功能性預測,是一種篩選候選功能位點的理想策略,目前已有諸多成功的研究報道[3-6]。BCO2基因(Beta-carotene 9′,10′-monooxygenase,BCO2)編碼的β-胡蘿卜素加氧酶2在動物體內(nèi)類胡蘿卜素的代謝過程中起著至關(guān)重要的作用[7]。雞皮膚表現(xiàn)出黃色主要是由于表皮層類胡蘿卜素沉積的結(jié)果,類胡蘿卜素被降解,雞皮膚呈現(xiàn)白色。研究發(fā)現(xiàn),雞BCO2基因的一個G/A突變位點(chr24:6268434bp)與黃皮膚性狀存在著連鎖關(guān)系,且該基因在黃色皮膚組織中的表達量顯著低于白色皮膚組織[8]。還發(fā)現(xiàn),在綿羊、家兔等動物的黃脂肪性狀也與BCO2基因編碼區(qū)的突變有關(guān)[9-11],這提示BCO2基因突變可以造成它介導類胡蘿卜素降解的功能發(fā)生改變。本研究對利用生物信息技術(shù)對雞BCO2基因編碼區(qū)nsSNPs進行分析,篩選其中候選功能性錯義突變位點,為后續(xù)的表型關(guān)聯(lián)分析和雞皮膚顏色的分子遺傳育種提供理論依據(jù)。

    1? 材料與方法

    1.1? BCO2基因nsSNPs的搜集? 以BCO2基因的序列號(ENSGALG00000007868)從Ensembl genome browser(http://asia.ensembl.org)中進行檢索,確定各SNPs在基因中的位置(外顯子區(qū)、內(nèi)含子區(qū)、啟動子區(qū)域等),篩選出位于編碼區(qū)的nsSNPs。

    1.2? NsSNPs對BCO2基因功能的影響? 應(yīng)用4種預測方法SIFT(http://blocks.fhcrc.org/sift/SIFT.html)[12]、PolyPhen-2(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2)[13]、PANTHER(http://pantherdb.org/tools/csnpScoreForm.jsp)[14]和PROVEN(http://provean.jcvi.org/seq_submit.php)[15]軟件分析各nsSNP對進行BCO2蛋白功能的影響。

    1.3? 進化保守位點分析? 利用在線服務(wù)器ConSurf(http://consurftest.tau.ac.il)[16]分析BCO2蛋白氨基酸位點的進化保守水平。越保守位點發(fā)生變異越可能造成功能或結(jié)構(gòu)上的影響。

    1.4? 翻譯后修飾位點預測? 分別利用BDM-PUB(http://bdmpub.biocuckoo.org/)和NetPhos 2.0(http://gps.biocuckoo.org/)[17]在線軟件預測BCO2蛋白質(zhì)氨基酸泛素化修飾位點和預測磷酸化修飾位點。

    1.5? 蛋白質(zhì)穩(wěn)定性分析? 利用I-Mutant 2.0(http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/I-Mutant2.0/I-Mutant2.0.cgi)[18]在線軟件評估nsSNP引起的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的改變。在評估結(jié)果中,DDG為自由能變化值,DDG<0表示此nsSNP降低了蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性,DDG>0表示此nsSNP增加了蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性,-0.05≤DDG≤0.05表示蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性變化為中性。RI(Reliability Index)為可靠性指數(shù),范圍在0~10。

    2? 結(jié)果與分析

    2.1? 雞BCO2基因nsSNPs的篩選結(jié)果? 從SNP數(shù)據(jù)庫中共檢索到BCO2基因兩個轉(zhuǎn)錄子:

    BCO2-201(ENSGALT00000043097);

    BCO2-202(ENSGALT00000012775)。

    8個nsSNPs,具體結(jié)果見表1。

    2.2? 雞BCO2基因有害nsSNPs預測結(jié)果? 采用SIFT、PolyPhen-2、PANTHER和PROVEN四種方法在BCO2-201分別預測到4個、5個、3個和3個有害突變,在BCO2-202分別預測到4個、4個、3個和3個有害突變。其中rs736211538、rs735703078在兩個轉(zhuǎn)錄子、BCO2-201的rs739117331和BCO2-201的rs736989374均至少三種方法預測為有害位點。

    2.3? 進化保守位點分析? 利用在線服務(wù)器ConSurf預測BCO2基因的進化保守位點,分數(shù)在7~9之間的位點為進化保守性位點。如表2所示,在BCO2編碼的多肽鏈氨基酸序列中,與多態(tài)位點一致的保守性位點共有3個,分別為rs739117331、rs735703078和rs736211538,這3個位點的多態(tài)性更容易對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或功能造成影響。

    2.4? 翻譯后修飾位點預測? 本研究利用BDM-PUB在線軟件預測泛素化修飾位點,利用NetPhos 2.0預測磷酸化修飾位點(表3)。結(jié)果,與BCO2蛋白多態(tài)位點一致的泛素化修飾位點為K416,磷酸化修飾位點為S535。

    2.5? 蛋白質(zhì)穩(wěn)定性分析? 利用I-Mutant2.0評估nsSNP引起的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響(見表4),可見BCO2-202中除D510E和K416N使蛋白質(zhì)穩(wěn)定性升高,其他位點多態(tài)性均使得蛋白質(zhì)穩(wěn)定性下降;BCO2-201中除D354A和K260N使蛋白質(zhì)穩(wěn)定性升高,其他位點多態(tài)性均使得蛋白質(zhì)穩(wěn)定性下降。

    2.6? 蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)建模? 利用在線建模服務(wù)器SWISS-MODEL為雞BCO2-201和BCO2-202兩個轉(zhuǎn)錄子蛋白質(zhì)突變體建模,并利用軟件PyMOL將功能性錯義突變分別定位到BCO2-201(圖1A)和BCO2-202(圖1B)蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)。

    3? 討論與結(jié)論

    本研究通過蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能特性這個角度驗證雞的BCO2基因編碼區(qū)中的nsSNPs是否有害。首先,從Ensembl檢索到BCO2基因編碼區(qū)8個nsSNPs,并用四款軟件對其進行功能預測,初步篩選出候選的有害nsSNPs;同時,本研究又從蛋白質(zhì)翻譯后修飾以及氨基酸位點進化保守水平的角度對候選nsSNPs潛在生物學功能進行評估。在發(fā)現(xiàn)的8個nsSNPs中,其中D371A被4個方法均預測為有害突變;進化保守性預測結(jié)果也顯示D371屬于高度保守,這意味著該位點對BCO2功能正常發(fā)揮十分重要。因此D371A在BCO2所有的nsSNPs中危害最大,相應(yīng)的多態(tài)位點為功能性位點。另外,位點S535A為磷酸化修飾位點,它可破壞影響蛋白質(zhì)之間的信號傳導致使蛋白質(zhì)功能不能正常發(fā)揮,加之有3個方法均預測S535A為有害突變,同時S535還是保守性位點,所以S535A為第2個功能位點。第3個候選功能位點為T331P,該位點也被3個nsSNPs功能預測軟件預測為有害突變,且該位點也是進化保守性位點,因此不可忽視該突變對BCO2蛋白質(zhì)功能的影響;最后,雖然K416為泛素化修飾位點,該位點突變可能通過影響蛋白質(zhì)合成后的泛素化過程,破致使蛋白質(zhì)功能不能正常發(fā)揮,但4種軟件對K416N的預測結(jié)果均為中性,因此該突變有待進一步研究。

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    基金項目:河北省教育廳重點項目(項目編號:ZD2018225),河北科技師范學院博士啟動基金(項目編號:2018YB002),河北省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系蛋雞產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團隊崗位項目(項目編號:HBCT2013090206)。

    作者簡介:郝文文(1996-),女,研究生在讀,研究方向為家禽遺傳育種,E-mail:794911295@qq.com。

    通訊作者:張傳生(1976-),男,寧陽縣人,教授,主要從事動物遺傳育種的研究。E-mail:cszhang1976@126.com。

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