人鉀離子通道調(diào)節(jié)蛋白的原核表達及純化①

郭林紅 周 煒

(北京大學(xué)第一醫(yī)院風濕免疫科,北京100034)

人含有鉀離子四聚化結(jié)構(gòu)域蛋白(Potassium channel tetramerization domain-containing protein，KCTD)是一個包含25個成員的蛋白質(zhì)家族，其中每個成員的N-末端都包含一個與鉀離子通道四聚化T1結(jié)構(gòu)域類似的結(jié)構(gòu)域，但每個成員的C-末端序列不同，有著不同的生物功能[1]。目前該蛋白質(zhì)家族的結(jié)構(gòu)功能研究尚不深入，有文獻報道，KCTD蛋白家族的一些成員可能參與癌癥的發(fā)生或發(fā)展，如 KCTD9位于染色體8p22片段上，這個片段在肝癌、肺癌及其他許多癌癥中常常缺失；KCTD10和KCTD12可能與胃腸道間質(zhì)瘤有關(guān)[2]。

鉀離子通道調(diào)節(jié)蛋白(Potassium channel regulator,KCNRG)是KCTD的家族成員之一，其基因位于染色體13q14.3片段上，包括3個外顯子和2個剪接異構(gòu)體，分別編碼KCNRG-L(mRNA isoform NM-173605.1，272aa)和KCNRG-S(mRNA isoform NM-199464.2，229aa)兩種亞型蛋白，它們的C端不同，具有184aa長度的共N端，其中四聚化T1結(jié)構(gòu)域覆蓋位置含7～98氨基酸[3,4]。慢性淋巴細胞白血病、多發(fā)性骨髓瘤以及前列腺癌的發(fā)生可能與該基因的缺失、突變有關(guān)，同時KCNRG也可能是一個抑癌基因[3-5]。有文獻報道KCNRG蛋白可以通過四聚化T1結(jié)構(gòu)域形成多聚體，對電壓門控鉀離子通道hKv1.1和hKv1.4產(chǎn)生作用，減少鉀離子內(nèi)流[5]。KCNRG影響腫瘤生成的分子機制還不清楚，而明確KCNRG與其他蛋白的相互作用，是闡明其抑癌機制的關(guān)鍵。在基因組水平使用酵母雙雜交技術(shù)篩查蛋白-蛋白相互作用的研究中，KCNRG可能與CCNK、FXR2、DGCR6L、AP5B1以及自身相互作用，其中一些蛋白-蛋白相互作用(如KCNRG與CCNK)可能與細胞增殖相關(guān)，但上述結(jié)果需要使用更多方法進一步驗證[6]。

還有文獻報道KCNRG蛋白主要分布在小氣道上皮細胞，并在I型自身免疫性多內(nèi)分泌腺病綜合征(Autoimmune polyglandular syndrome type 1,APS-1)合并肺部疾病患者的血清中檢測到了針對該蛋白的自身抗體，提示KCNRG可能是自身免疫性肺損傷的肺組織特異性抗原[7]。但是在另一篇文獻中，APS-1合并肺部疾病的患者中并未檢測到抗KCNRG抗體[8]。因此，KCNRG是否為自身免疫性肺病相關(guān)的自身抗原需要更多研究。在急性呼吸窘迫綜合征和嚴重膿毒血癥患者的血清中也同樣檢測到了該抗體，并與肺損傷和組織破壞程度相一致[9]。KCNRG自身抗體的產(chǎn)生是肺臟損傷的后果還是原因，需要在恰當模型中打破該蛋白的免疫耐受，對其相關(guān)免疫反應(yīng)進行研究。

無論是對KCNRG進行蛋白-蛋白相互作用的研究，還是作為抗原進行相關(guān)疾病的血清學(xué)檢測或免疫動物探討打破免疫耐受的后果，均需要得到大量純化的KCNRG重組蛋白。目前關(guān)于KCNRG蛋白的表達純化還未見報道。本研究以pcDNA3.1-KCNRG-2ex質(zhì)粒[3]為模板特異性擴增人KCNRG的編碼區(qū)序列，并將該序列通過特異性雙酶切插入原核表達載體pET28a-MBP-His和pGEX-4T-1中，構(gòu)建pET28a-KCNRG-MBP-His和pGEX-4T-1-KCNRG載體，最終探討和優(yōu)化KCNRG融合蛋白體外誘導(dǎo)表達的流程，為KCNRG的高效表達和純化提供方法與經(jīng)驗。表達的KCNRG蛋白可用于研究蛋白間相互作用、腫瘤發(fā)生的分子機制，也可以作為抗原免疫動物建立動物模型，為進一步研究KCNRG蛋白產(chǎn)生免疫反應(yīng)的相關(guān)疾病機制奠定良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒與菌株 質(zhì)粒：pET28a-MBP-His和pGEX-4T-1載體由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)趙要風教授饋贈，pcDNA3.1-KCNRG-2ex載體由Mikhail Skoblov教授饋贈[3]。菌株：大腸桿菌Rosetta(DE3)購于TIANGEN公司；TOP10為本實驗室保存菌種。

1.1.2 試劑 PCR MasterMix、DNA Marker、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購于Tiangen公司；XhoⅠ和NdeⅠ限制性內(nèi)切酶購于Thermo公司；異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)購于上海生物工程有限公司；溶菌酶、PMSF、小鼠抗6×His單克隆抗體購于上海生物工程有限公司；小鼠抗GST單克隆抗體購于Santa公司；Ni-NTA Agarose購于Qiagen公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 根據(jù)pcDNA3.1-KCNRG-2ex質(zhì)粒擴增KCNRG目的基因(NM-173605.1)，設(shè)計引物，引入NdeⅠ和XhoⅠ酶切位點以克隆入pET28a-MBP-His載體，引入BamHⅠ、NotⅠ酶切位點以克隆入pGEX-4T-1載體。KCNRG-F1：GCACATATGATGAGTAGTCAGGAACTGGTCACTTTG;KCNRG-R1：GC-ACTCGAGTCATTTCTTTATCTGAGATTGCTCTGG;KCNRG-F2：GCAGGATCCATGAGTAGTCAGG-AACTGGTC;KCNRG-R2：GCAGCGGCCGCTCATTT-CTTTATCTGA-GATTGCTCT。

1.2.2 KCNRG目的基因的擴增 以pcDNA3.1-KCNRG-2ex質(zhì)粒為模板進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為：92℃ 3 min；92℃ 30 s；55℃ 30 s；72℃ 1 min，35個循環(huán)；72℃ 5 min，PCR產(chǎn)物4℃保存。取2 μl PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.3 pET28a-KCNRG-MBP-His和pGEX-4T-1-KCNRG重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建 用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物，參照說明書進行具體操作。用NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切pET28a-MBP-His、BamHⅠ和NotⅠ雙酶切pGEX-4T-1及PCR回收產(chǎn)物，37℃水浴條件下酶切5 h。將酶切后的產(chǎn)物再次用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行純化回收。按照目的基因與載體物質(zhì)的量比3∶1，用T4 DNA連接酶將雙酶切的KCNRG基因連接在原核表達載體pET28a-MBP-His和pGEX-4T-1上，22℃水浴條件下連接2 h。將連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細菌中，分別涂布于含有卡那霉素(Kan)和氨芐青霉素(Amp)的LB平板，37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)16 h。挑取長勢良好的單克隆菌落的一半為模板進行PCR，對克隆的KCNRG目的基因進行鑒定。挑取菌落PCR陽性的菌落分別接種在含Kan抗性和Amp抗性的LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。使用質(zhì)粒小量提取試劑盒按照說明書提取單克隆菌液中的質(zhì)粒，分別通過內(nèi)切酶NdeⅠ、XhoⅠ和BamHⅠ、NotⅠ雙酶切驗證陽性克隆。將雙酶切產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行分析。將鑒定成功的重組質(zhì)粒送北京美吉桑格生物醫(yī)藥科技有限公司測序。測序結(jié)果經(jīng)BLAST比對分析，比對序列和人的KCNRG CDS區(qū)序列完全相同，并命名質(zhì)粒為pET28a-KCNRG-MBP-His和pGEX-4T-1-KCNRG。

1.2.4 KCNRG基因在pET28a-KCNRG-MBP-His和pGEX-4T-1-KCNRG載體中的原核表達 將提取的重組質(zhì)粒pET28a-KCNRG-MBP-His和pGEX-4T-1-KCNRG分別轉(zhuǎn)化到Rosetta(DE3)感受態(tài)細胞中，挑取單克隆菌落分別接種于含Kan抗性和Amp抗性的LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。取過夜的菌液按照1∶100的濃度分別接種含Kan和Amp的LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6。誘導(dǎo)前取1 ml菌液，存于4℃。加入終濃度為1.0 mmol/L 的IPTG進行誘導(dǎo)融合蛋白表達。誘導(dǎo)后4 h取1 ml菌液，5 000 r/min離心5 min后棄上清，分別加入100 μl PBS重懸，加入終濃度為1 mg/ml 的溶菌酶混勻，冰上放置15 min后加入終濃度為1.0 mmol/L的PMSF混勻。液氮反復(fù)凍融7、8次后，4℃ 12 000 r/min離心15 min，分別取上清和沉淀進行SDS-PAGE電泳及考馬斯亮藍染色，對融合蛋白KCNRG的表達進行鑒定。

1.2.5 鑒定KCNRG融合蛋白 將上述誘導(dǎo)樣品進行SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入一抗(1∶2 000)小鼠抗6×His單克隆抗體及一抗(1∶200)小鼠抗GST單克隆抗體，4℃孵育過夜。TBST洗膜3次，10 min/次，再加入二抗(1∶5 000)HRP標記的山羊抗小鼠IgG抗體，室溫孵育1 h，TBST洗膜2次，10 min/次，TBS洗膜10 min，ECL發(fā)光、照相。

1.2.6 親和層析純化融合蛋白KCNRG 將甘油菌pET28a-KCNRG-MBP-His復(fù)蘇，于37℃振蕩培養(yǎng)過夜，次日按照1∶100的濃度接種于含抗生素Kan的250 ml LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)0.4～0.6 h，經(jīng)過優(yōu)化組合，加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG，37℃誘導(dǎo)融合蛋白表達4 h。將所有菌液5 000 r/min 離心5 min棄上清，加入3 ml的binding/wash buffer 重懸菌體，加入終濃度為1 mg/ml 的溶菌酶混勻，冰上放置15 min 后加入終濃度為1.0 mmol/L的PMSF混勻。液氮反復(fù)凍融5～6次后，按照功率300 W，超5 s，停 5 s，冰上超聲破碎10～15 min。4℃、12 000 r/min離心15 min，收取上清。上清用0.22 μm膜過濾。通過Ni2+親和層析柱純化樣品，以10 mmol/L咪唑緩沖液洗脫雜蛋白，250 mmol/L咪唑緩沖液洗脫目的蛋白。用SDS-PAGE檢測純化的蛋白，并測定蛋白純度和濃度。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增產(chǎn)物電泳鑒定結(jié)果 PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳，結(jié)果如圖1(A：用含有內(nèi)切酶NdeⅠ、XhoⅠ的特異引物擴增；B：用含有內(nèi)切酶BamHⅠ、NotⅠ的特異引物擴增)所示。使用設(shè)計的引物以pcDNA3.1-KCNRG-2ex質(zhì)粒為模板，成功擴增出了特異性目的條帶，其大小與預(yù)計的819 bp相一致。

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定結(jié)果 使用KCNRG的PCR引物進行菌落PCR鑒定，從圖2可以看出，PCR產(chǎn)物與目的基因KCNRG長度相一致的明顯條帶。圖3中，pET28a-KCNRG-MBP-His重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切的產(chǎn)物分別約為819 bp、6.4 kb兩個條帶(A)。pGEX-4T-1-KCNRG重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、NotⅠ雙酶切的產(chǎn)物分別約為819 bp、4.9 kb兩個條帶(B)。初步證明重組質(zhì)粒含有目的基因。

2.3 重組質(zhì)粒表達產(chǎn)物分析 用重組質(zhì)粒pET28a-KCNRG-MBP-His和pGEX-4T-1-KCNRG轉(zhuǎn)染Rosetta(DE3)感受態(tài)細胞。用1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)重組菌。KCNRG目的基因為819 bp，大小約30 kD，pET28a-MBP-His載體上的融合蛋白MBP大小約為42 kD，故KCNRG-MBP融合蛋白大小應(yīng)在72 kD左右，從圖4A可以看出，在70～100 kD之間，泳道2和泳道4有明顯目標條帶出現(xiàn)，說明目標蛋白在上清和沉淀中均有表達；pGEX-4T-1-KCNRG載體上的融合蛋白GST大小約26 kD，故GST-KCNRG融合蛋白大小應(yīng)在56 kD左右，從圖4B?？梢钥闯?，在55～70 kD之間，泳道4有明顯目標條帶出現(xiàn)，說明目標蛋白主要在沉淀中表達。

圖1 PCR擴增KCNRG基因Fig.1 PCR amplification of KCNRGNote: M.D2000 DNA marker；1.PCR amplification of KCNRG.

2.4 重組蛋白的Western blot鑒定 將蛋白粗提物進行SDS-PAGE電泳后， 轉(zhuǎn)PVDF膜， 進行Westernblot鑒定。結(jié)果顯示，圖5A中無論上清還是沉淀，PVDF膜上在72 kD大小處有一明顯條帶產(chǎn)生；圖5B中只有沉淀中，PVDF膜上在56 kD大小處有一明顯條帶產(chǎn)生。與融合蛋白的大小一致，證明KCNRG融合蛋白成功表達。

圖2 重組質(zhì)粒pET28a-KCNRG-MBP-His和pGEX-4T-1-KCNRG的菌落鑒定結(jié)果Fig.2 Identification of recombinant plasmids pET28a-KCNRG-MBP-His and pGEX-4T-1-KCNRG with colony PCRNote: M.D2000 DNA marker；1-4.PCR product of the colony.

圖3 雙酶切驗證重組質(zhì)粒pET28a-KCNRG-MBP-His和pGEX-4T-1-KCNRGFig.3 Identification of recombinant plasmids pET28a-KCNRG-MBP-His and pGEX-4T-1-KCNRG with restriction enzyme digestionNote: A.M1.D2000 DNA marker；1.pET28a-KCNRG-MBP-His was digested by NdeⅠ and XhoⅠ enzymes；M2.D15000+2000 DNA marker;B.M1.D2000 DNA marker；1.pGEX-4T-1-KCNRG was digested by BamHⅠ and NotⅠ enzymes；M2.D15000+2000 DNA marker.

2.5 KCNRG融合蛋白純化SDS-PAGE電泳圖 經(jīng)過不同溫度和不同IPTG誘導(dǎo)濃度組合，以IPTG終濃度0.1 mmol/L，37℃誘導(dǎo)4 h擴大培養(yǎng)。圖6中在70～100 kD處有明顯單一的目的條帶，通過凝膠成像系統(tǒng)軟件分析純化蛋白的純度>90%，BCA法測定蛋白濃度，250 ml菌液收集融合蛋白KCNRG約為5.7 mg，說明獲得了較好純度和濃度的目的蛋白。

圖4 SDS-PAGE檢測KCNRG的表達Fig.4 Detection of KCNRG expression by SDS-PAGNote: A.M.10-180 kD marker； 1.Supernatant of pET28a-KCNRG-MBP-His bacteria without induction；2.Supernatant of induced pET28a-KCNRG-MBP-His bacteria；3.Deposition of pET28a-KCNRG-MBP-His bacteria without induction；4.Deposition of induced pET28a-KCNRG-MBP-His bacteria;B.M.10-180 kD marker；1.Supernatant of induced pGEX-4T-1 bacteria；2.Supernatant of induced pGEX-4T-1-KCNRG bacteria；3.Deposition of induced pGEX-4T-1 bacteria；4.Deposition of induced pGEX-4T-1-KCNRG bacteria.

圖5 用抗6×His單抗(A)和抗GST單抗(B)檢測KCNRG融合蛋白Fig.5 Detection of KCNRG fusion protein by Western blot using anti-6×His antibody(A)and anti-GST antibody(B)Note: A.M.10-180 kD marker；1.Deposition of induced pET28a-KCNRG-MBP-His bacteria；2.Supernatant of induced pET28a-KCNRG-MBP-His bacteria;B.M.10-180 kD marker；1.Deposi-tion of induced pGEX-4T-1-KCNRG bacteria；2.Supernatant of induced pGEX-4T-1-KCNRG bacteria.

圖6 SDS-PAGE分析純化的KCNRG融合蛋白Fig.6 Analysis of purified KCNRG fusion protein by SDS-PAGENote: M.10-180 kD maker；1.Purified KCNRG fusion protein.

3 討論

大腸桿菌表達系統(tǒng)是基因表達技術(shù)中發(fā)展最早和目前應(yīng)用最廣的經(jīng)典表達系統(tǒng)[10]。其具有遺傳背景清楚、培養(yǎng)操作簡單、生長繁殖快、成本低、產(chǎn)量高、表達產(chǎn)物純化過程簡單、產(chǎn)物穩(wěn)定性好、不易污染等優(yōu)點，得到了廣泛應(yīng)用，并取得了巨大的科研價值和經(jīng)濟效益[11-13]。目前在科研和工業(yè)上被廣泛應(yīng)用的大腸桿菌表達載體主要有pGE系列、pQE系列和pET系列，其中被廣泛應(yīng)用的高效表達載體是pET[11]。pET表達載體中，目標基因被克隆到PET表達載體上，受T7噬菌體強轉(zhuǎn)錄和翻譯信號控制，并通過宿主細胞提供T7 RNA聚合酶來誘導(dǎo)表達，但不足之處在于多數(shù)是以包涵體的形式存在[10]。融合表達載體是將融合蛋白基因與外源基因結(jié)合，利用融合信號肽將融合蛋白分泌到細胞周質(zhì)或胞外表達，有利于形成二硫鍵以及避免胞質(zhì)蛋白酶的水解，并有利于目的蛋白的分離和純化，其包括谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)系統(tǒng)、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)系統(tǒng)、純化標簽融合系統(tǒng)等[11,14]。GST的分子量約為26 kD，作為一種分子伴侶可以高效促進蛋白質(zhì)完成正確折疊，形成有功能的區(qū)域、增強蛋白的可溶性和幫助重組蛋白免受蛋白酶的水解，穩(wěn)定融合蛋白的結(jié)構(gòu)[15]。MBP的分子量大小約為42 kD，是目前應(yīng)用范圍最廣泛的促使外源蛋白可溶性表達的分子伴侶，可提高與其融合的蛋白質(zhì)或多肽的可溶性，有利于形成二級結(jié)構(gòu)，保持目的蛋白的良好抗原性[10,15,16]。作為外源基因的表達宿主，BL12(DE3)添加了T7聚合酶基因，是為T7表達系統(tǒng)而設(shè)計的[17,18]。Rosetta(DE3)來源于BL-21(DE3)，其含有pRARE質(zhì)粒，能夠提供含有AGG、AGA、AUA、CUA、CCC和GGA稀有密碼子的tRNA，從而大大提高了目的蛋白的表達量[19,20]。

本實驗起初選擇了pGEX-4T-1表達載體，經(jīng)過多種組合，目的蛋白未能在上清中大量表達，主要以包涵體形式存在。換用pET28a-MBP-His融合表達載體后，誘導(dǎo)溫度在37℃條件下，就可以獲得大量的可溶性目的蛋白，也進一步證實了MBP系統(tǒng)的水溶性較大，可以提高與其融合的蛋白質(zhì)的可溶性。本研究使用pET28a載體表達KCNRG-MBP融合蛋白，在Rosetta(DE3)菌株中，可以高效生產(chǎn)高純度重組蛋白。得到的重組蛋白為后續(xù)進行蛋白質(zhì)體外結(jié)合實驗驗證蛋白-蛋白相互作用、質(zhì)譜分析深入研究KCNRG的作用機制及蛋白間的相互作用提供了有力工具，為深入認識KCNRG對于癌癥的調(diào)控機制奠定了基礎(chǔ)。重組KCNRG可以作為抗原，使用ELISA或免疫印跡等方法對相關(guān)疾病患者血清進行檢測，明確抗KCNRG與自身免疫性肺部疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。得到的重組蛋白還可以作為抗原免疫小鼠，如果其免疫小鼠能夠造成肺部病變，證實它是與自身免疫病相關(guān)的肺組織特異自身抗原，建立的動物模型將成為研究自身免疫病相關(guān)肺部病變發(fā)病機制的重要手段。