紅景天苷對缺氧復(fù)氧星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞損傷的影響

許德超 方麗麗 陳 輝 王穎怡

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)五科，齊齊哈爾161006)

在腦組織中星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量遠(yuǎn)高于神經(jīng)元，是哺乳動物體內(nèi)數(shù)量最多的腦細(xì)胞，對腦組織正常功能的維持具有重要作用[1]。腦缺血再灌注損傷是常見的腦組織損傷，星形膠質(zhì)細(xì)胞與腦組織的毛細(xì)血管緊密相連，腦缺血再灌注損傷發(fā)生時，星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷是早期事件。損傷的星形膠質(zhì)細(xì)胞不僅能夠直接影響腦組織的正常功能，還可以通過促進(jìn)炎癥反應(yīng)殺傷周圍正常的神經(jīng)元細(xì)胞，減輕缺氧復(fù)氧星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷是治療腦缺血再灌注的關(guān)鍵[2]。紅景天苷(Salidroside)是一種紅景天科植物中提取出的有效活性成分，具有抗氧化、消炎等功效，對于腎組織損傷、心肌損傷等均具有保護(hù)作用[3,4]。最近有研究顯示，紅景天苷對于腦缺血再灌注損傷大鼠具有保護(hù)作用，其能夠降低損傷腦組織中氧化應(yīng)激水平，減輕腦組織炎癥反應(yīng)，對于大鼠神經(jīng)功能也具有改善作用[5,6]。本實(shí)驗(yàn)分離培養(yǎng)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞，通過探討紅景天苷對缺氧復(fù)氧星形膠質(zhì)細(xì)胞氧化損傷、炎癥因子分泌等過程的影響，明確紅景天苷對體外缺氧復(fù)氧星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用，為紅景天苷應(yīng)用于腦缺血再灌注的臨床治療提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 出生1～2 d的SD大鼠由齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院提供，雌雄不限。紅景天苷購自上海哈靈生物科技有限公司；乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase，LDH)含量檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)活性檢測試劑盒購自美國Sigma；還原型谷胱甘肽(Glutathione，GSH)活性檢測試劑盒及丙二醛(Malonaldehyde，MDA)含量檢測試劑盒購自南京建成生物研究所；活化型Caspase-3(Cleaved Caspase-3)抗體購自美國AbSci；CCK8細(xì)胞活力檢測試劑盒購自南京恩晶生物科技有限公司；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、IL-6含量檢測試劑盒購自美國Thermo；活化型Caspase-9(Cleaved Caspase-9)抗體購自美國Cell Signaling Technology；線粒體膜電位檢測試劑盒購自南京森貝伽生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 星形膠質(zhì)細(xì)胞分離培養(yǎng) 參照文獻(xiàn)[7]步驟，取出生1～2 d的SD大鼠，分離腦組織，加入DMEM洗滌3次，將血管和腦膜組織剔除以后，取大腦皮質(zhì)，剪碎，在組織中加入0.25%胰蛋白酶，37℃孵育8 min，150目篩網(wǎng)過濾，加入D-Hanks液洗滌，1 200 g離心5 min。添加含有青鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液(含有10%胎牛血清)，混合后，接種到多聚賴氨酸包被后的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞接種密度為5×105個/ml，放在飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2 d，換液，繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞長滿以后，在37℃、220 r/min條件下振蕩孵育18 h，將小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元去除，用0.25%的胰蛋白酶將貼壁的細(xì)胞消化，將細(xì)胞接種到多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)7 d，經(jīng)GFAP免疫熒光鑒定為星形膠質(zhì)細(xì)胞。

1.2.2 缺氧復(fù)氧模型構(gòu)建及細(xì)胞分組 缺氧復(fù)氧模型構(gòu)建參照文獻(xiàn)[2]，取星形膠質(zhì)細(xì)胞，用PBS將細(xì)胞洗滌3次，換成無血清的低糖培養(yǎng)液，置于1%O2、5%CO2、94%N2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)6 h，將低糖培養(yǎng)液吸除，加入含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，放在5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18 h。星形膠質(zhì)細(xì)胞在缺氧復(fù)氧前4 h向細(xì)胞培養(yǎng)液中加入紅景天苷，使其終濃度為80、160、320 mmol/L，分別記為Salidroside-L、Salidroside-M、Salidroside-H。設(shè)置H/R組，H/R組在缺氧復(fù)氧前4 h，用0 mmol/L紅景天苷細(xì)胞培養(yǎng)液預(yù)處理。設(shè)置Control組，Control組用0 mmol/L紅景天苷細(xì)胞培養(yǎng)液預(yù)處理，不進(jìn)行缺氧復(fù)氧處理。

1.2.3 CCK8檢測 將星形膠質(zhì)細(xì)胞接種到96孔板內(nèi)，按照Control、H/R、Salidroside-L、Salidroside-M、Salidroside-H分組處理，在每個孔內(nèi)加入10 μl的CCK8溶液，放在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，把沒有添加細(xì)胞的孔作為空白調(diào)零孔，檢測紫外-可見分光度計(jì)450 nm處每孔的吸光度值(A值)，計(jì)算細(xì)胞存活率變化。存活率=100%×(實(shí)驗(yàn)組A值/Control組A值)。

1.2.4 LDH漏出率檢測 各組細(xì)胞按照上述方法處理以后，收集Control、H/R、Salidroside-L組、Salidrosi-de-M、Salidroside-H組細(xì)胞和培養(yǎng)液上清，用LDH含量檢測試劑盒(二硝基苯肼法)檢測上清和細(xì)胞中LDH含量，計(jì)算LDH漏出率。LDH漏出率=100%×上清中LDH含量/(上清中LDH含量+細(xì)胞中LDH含量)。

1.2.5 細(xì)胞SOD活性、GSH活性及MDA含量檢測 各組細(xì)胞按照上述方法處理以后，收集Control、H/R、Salidroside-L、Salidroside-M、Salidroside-H組細(xì)胞，在細(xì)胞中添加0.1 mol/L TBA、0.05 mmol/L EDTA溶液，混合后，加入1%Triton-X100 50 μl，置于振蕩器上反應(yīng)1 min，加入100 μl的HPO3溶液將蛋白沉淀，4℃、12 000 r/min離心10 min，使用SOD活性檢測試劑盒(黃嘌呤氧化法)、GSH活性檢測試劑盒(改良二硫雙硝基苯甲酸定量法)、MDA含量檢測試劑盒(硫代巴比妥酸法)分別檢測SOD活性、GSH活性及MDA含量。

1.2.6 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平檢測 各組細(xì)胞按照上述方法處理以后，收集Control、H/R、Salidroside-L、Salidroside-M、Salidroside-H組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用ELISA法分別檢測TNF-α、IL-1β、IL-6含量，步驟按照試劑盒標(biāo)準(zhǔn)流程操作。

1.2.7 細(xì)胞凋亡檢測 各組細(xì)胞按照上述方法處理以后，收集Control、H/R、Salidroside-L、Salidroside-M、Salidroside-H組細(xì)胞，用PBS洗滌，收集5×105個細(xì)胞，在細(xì)胞中添加500 μl的Binding Buffer，再加入Annexin V-FITC 5 μl和PI 5 μl，放在室溫中避光反應(yīng)10 min，經(jīng)400目的尼龍網(wǎng)過濾，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡變化。

1.2.8 細(xì)胞線粒體膜電位檢測 收集Control、H/R、Salidroside-L、Salidroside-M、Salidroside-H組細(xì)胞，加入0.25%的胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，PBS洗滌3次，在細(xì)胞中加入羅丹明123避光孵育30 min，用流式細(xì)胞儀檢測，結(jié)果以Control組為對照，分析各組細(xì)胞線粒體膜電位變化。

1.2.9 Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白水平檢測 收集Control、H/R、Salidroside-L、Salidro-side-M、Salidroside-H組細(xì)胞，在細(xì)胞中添加蛋白裂解液，冰上充分裂解，4℃，12 000 g離心10 min。將上清分裝，保存在-80℃。用BCA法對蛋白定量檢測，在蛋白中添加1/4體積的5×上樣緩沖液，置于沸水中反應(yīng)10 min。每孔上樣量為30 μg，在80 V電壓條件下觀察預(yù)染的Marker開始分離以后，調(diào)節(jié)電壓至120 V，電泳約2 h后，90 V電壓將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，經(jīng)封閉液(5%牛血清白蛋白)室溫封閉1.5 h，再與TBST按照1∶500稀釋的一抗在4℃孵育過夜，再與TBST按照1∶3 000稀釋的二抗室溫反應(yīng)1 h，ECL發(fā)光，用Bio-Rad分析圖像，根據(jù)條帶的光密度值分析蛋白表達(dá)水平，內(nèi)參為GAPDH。

2 結(jié)果

2.1 紅景天苷對缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞活力和LDH漏出率的影響 結(jié)果見圖1和表1，缺氧復(fù)氧后的星形膠質(zhì)細(xì)胞的存活率降低，細(xì)胞LDH漏出率升高，缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷。用高、中、低濃度的紅景天苷處理缺氧復(fù)氧星形膠質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞的存活率升高，LDH漏出率降低，紅景天苷可以呈濃度依賴性減輕缺氧復(fù)氧星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷。

2.2 紅景天苷對缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞SOD活性、GSH活性和MDA含量的影響 結(jié)果見表2，缺氧復(fù)氧后的星形膠質(zhì)細(xì)胞SOD活性和GSH活性均降低，MDA含量升高，缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞氧化損傷。用高、中、低濃度的紅景天苷處理缺氧復(fù)氧星形膠質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞MDA含量降低，SOD活性、GSH活性升高，紅景天苷可以呈濃度依賴性減輕缺氧復(fù)氧星形膠質(zhì)細(xì)胞氧化損傷，提高細(xì)胞中抗氧化酶活性。

2.3 紅景天苷對缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌TNF-α、IL-1β、IL-6的影響 結(jié)果見表3，缺氧復(fù)氧后的星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)水平升高，缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌炎癥因子。用高、中、低濃度的紅景天苷處理缺氧復(fù)氧星形膠質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞分泌的TNF-α、IL-1β、IL-6減少，紅景天苷可以呈濃度依賴性減輕缺氧復(fù)氧星形膠質(zhì)細(xì)胞炎性損傷，減少細(xì)胞分泌炎癥因子。

圖1 各組星形膠質(zhì)細(xì)胞生長狀態(tài)Fig.1 Growth state of astrocytes in each group

GroupsSurvival rate(%)LDH leakage rate(%)Control100.00±0.005.63±0.78H/R51.23±4.171)18.56±1.471)Salidroside-L63.05±5.202)14.25±1.052)Salidroside-M79.15±6.582)3)10.43±1.142)3)Salidroside-H89.14±7.142)3)4)8.63±0.962)3)4)F41.59562.312P0.0000.000

Note：Compared with Control,1)P<0.05;compared with H/R,2)P<0.05；compared with Salidroside-L,3)P<0.05 compared with Salidroside-M,4)P<0.05.

2.4 紅景天苷對缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響 結(jié)果見圖2和表4，缺氧復(fù)氧后的星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡率升高，缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡。用高、中、低濃度的紅景天苷處理缺氧復(fù)氧星形膠質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率降低，紅景天苷可以呈濃度依賴性抑制缺氧復(fù)氧對星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用。

GroupsMDA content(μmol/L)SOD activity(nkat)GSH activity(nkat)Control1.89±0.130.036±0.0050.049±0.003H/R5.69±0.671)0.011±0.0021)0.020±0.0021)Salidroside-L3.95±0.452)0.018±0.0022)0.029±0.0032)Salidroside-M2.81±0.212)3)0.022±0.0012)3)0.036±0.0042)3)Salidroside-H2.01±0.142)3)4)0.027±0.0032)3)4)0.043±0.0022)3)4)F51.34430.94246.536P0.0000.0000.000

Note：Compared with Control,1)P<0.05;compared with H/R,2)P<0.05；compared with Salidroside-L,3)P<0.05；compared with Salidroside-M,4)P<0.05.

GroupsTNF-α(μg/ml)IL-1β(μg/ml)IL-6(μg/ml)Control47.56±6.2433.89±6.2162.41±5.32H/R990.14±95.121)564.32±42.851) 1 412.36±125.681)Salidroside-L712.46±62.832)385.62±35.062) 952.28±103.452)Salidroside-M558.20±50.782)3)251.02±20.632)3) 710.23±70.622)3)Salidroside-H 269.35±30.732)3)4) 140.20±12.582)3)4) 451.82±51.462)3)4)F123.539175.741113.917P0.0000.0000.000

Note：Compared with Control,1)P<0.05;compared with H/R,2)P<0.05；compared with Salidroside-L,3)P<0.05；compared with Salidroside-M,4)P<0.05.

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況Fig.2 Flow cytometry to detect cell apoptosis

GroupsApoptosis rate(%)Control8.46±0.92H/R36.51±3.251)Salidroside-L20.63±1.252)Salidroside-M16.02±1.132)3)Salidroside-H10.25±1.022)3)4)F123.580P0.000

Note：Compared with Control,1)P<0.05;compared with H/R,2)P<0.05；compared with Salidroside-L,3)P<0.05；compared with Salidroside-M,4)P<0.05.

圖3 Western blot檢測紅景天苷處理后缺氧復(fù)氧星形膠質(zhì)細(xì)胞中Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9蛋白水平Fig.3 Western blot to detect Cleaved Caspase-3 and Cleaved Caspase-9 protein expression in anoxia reoxygenation astrocytes after treatment with salidroside

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測紅景天苷處理后缺氧復(fù)氧星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體膜電位Fig.4 Flow cytometry to detect mitochondrial membrane potential in anoxia reoxygenation astrocytes after salidroside treatment

GroupsCleavedCaspase-3CleavedCaspase-9Mitochondrialmembrane potential(%)Control0.15±0.020.22±0.03100.00±0.00H/R0.51±0.051)0.53±0.061)41.25±3.581)Salidroside-L0.38±0.032)0.36±0.022)62.23±7.152)Salidroside-M0.24±0.022)3)0.28±0.032)3)76.92±6.322)3)Salidroside-H0.20±0.012)3)4)0.23±0.022)3)4)89.47±6.622)3)4)F75.45439.50854.203P0.0000.0000.000

Note：Compared with Control,1)P<0.05;compared with H/R,2)P<0.05；compared with Salidroside-L,3)P<0.05;compared with Salidroside-M,4)P<0.05.

2.5 紅景天苷對缺氧復(fù)氧星形膠質(zhì)細(xì)胞中Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)及線粒體膜電位的影響 結(jié)果見圖3、4和表5，缺氧復(fù)氧后的星形膠質(zhì)細(xì)胞中Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)水平升高，線粒體膜電位降低，缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體凋亡途徑激活。用高、中、低濃度的紅景天苷處理缺氧復(fù)氧星形膠質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞中Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)水平降低，線粒體膜電位升高，紅景天苷可以呈濃度依賴性抑制缺氧復(fù)氧對星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體凋亡途徑激活作用。

3 討論

腦缺血再灌注損傷的發(fā)生與氧自由基代謝異常、炎癥因子分泌等因素有關(guān)，星形膠質(zhì)細(xì)胞是腦組織中較大的膠質(zhì)細(xì)胞，其在腦組織中的分布遠(yuǎn)多于神經(jīng)元，腦缺血損傷發(fā)生首先會引起毛細(xì)血管周圍的星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷，而星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷后過度凋亡和釋放炎癥因子，可以促進(jìn)周圍細(xì)胞凋亡和炎癥發(fā)生[8,9]。LDH在正常細(xì)胞中常存在于細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞受到外界因素刺激以后，LDH分泌到細(xì)胞外，LDH漏出率是檢測細(xì)胞損傷的重要指標(biāo)[10]。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，缺氧復(fù)氧后的星形膠質(zhì)細(xì)胞活力降低，LDH漏出率升高，說明缺氧復(fù)氧星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷模型構(gòu)建成功。

氧自由基在人體多種器官和組織中廣泛存在，具有殺滅細(xì)菌、降解毒物等作用，其還是一種重要的免疫調(diào)節(jié)因子[11]。腦缺血再灌注損傷的發(fā)生與腦組織中氧自由基大量積累有關(guān)，過量的氧自由基能夠?qū)⒌鞍踪|(zhì)、脂質(zhì)、核酸等物質(zhì)過氧化，引起細(xì)胞功能異常，MDA是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，SOD和GSH等是機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的重要蛋白酶，SOD、GSH活性和MDA含量的高低是反映細(xì)胞氧化損傷程度的重要指標(biāo)[12,13]。另外，機(jī)體內(nèi)過量的氧自由基可以刺激線粒體，誘導(dǎo)線粒體膜電位下降，使細(xì)胞色素C進(jìn)入到胞質(zhì)，激活Caspase-9，誘導(dǎo)Caspase-3活化，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，這一過程又稱為線粒體凋亡途徑[14,15]。紅景天苷具有抗氧化、減少細(xì)胞凋亡等作用，對于過氧化氫等誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞、晶狀體上皮細(xì)胞等細(xì)胞氧化損傷具有保護(hù)作用[16,17]。本實(shí)驗(yàn)表明，紅景天苷處理缺氧復(fù)氧星形膠質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞SOD、GSH活性升高，MDA含量降低，細(xì)胞凋亡減少，細(xì)胞中活化的Caspase-3和Caspase-9蛋白水平降低，紅景天苷具有減輕缺氧復(fù)氧星形膠質(zhì)細(xì)胞氧化損傷、減少細(xì)胞凋亡的作用。

腦缺血再灌注產(chǎn)生大量的氧自由基，這些氧自由基不僅可以引起細(xì)胞損傷，還可以通過促進(jìn)炎癥因子釋放，誘發(fā)炎癥反應(yīng)而誘導(dǎo)周圍正常細(xì)胞功能損傷[18,19]。星形膠質(zhì)細(xì)胞是除中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞之外的腦缺血再灌注損傷炎癥細(xì)胞，具有合成和分泌TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子的作用，這些炎癥因子可以損傷周圍正常細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生[20-22]。研究顯示，紅景天苷具有降低腦缺血再灌注中炎癥反應(yīng)的功能，另外在肝缺血再灌注、哮喘等炎癥反應(yīng)中也具有抑制作用[23-25]。本實(shí)驗(yàn)表明，紅景天苷可以抑制缺氧復(fù)氧星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放TNF-α、IL-1β、IL-6，說明紅景天苷在缺氧復(fù)氧星形膠質(zhì)細(xì)胞中具有抗炎作用。

總而言之，紅景天苷具有減輕缺氧復(fù)氧星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞損傷的作用，可以減少星形膠質(zhì)細(xì)胞氧化損傷和炎癥因子釋放，對于細(xì)胞凋亡具有抑制作用，紅景天苷可以發(fā)展為治療腦缺血再灌注損傷的藥物，這對于紅景天苷治療腦缺血再灌注損傷具有重要的臨床應(yīng)用意義。