S1PR1基因慢病毒轉(zhuǎn)染對(duì)EAE小鼠調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及IL-17、IFN-γ水平的影響

張 瑤 李作孝

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，瀘州646000)

多發(fā)性硬化癥(Multiple sclerosis，MS)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system,CNS)自身免疫性炎癥性疾病，其病理特征為慢性炎性脫髓鞘，星型膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增殖，常伴有不同程度的軸突受損，目前MS的病因及發(fā)病機(jī)制尚未明確，研究表明MS可能是由遺傳因素和環(huán)境因素相互作用引發(fā)的免疫失調(diào)引起[1]。臨床上常用于MS的治療藥物包括大劑量甲潑尼龍沖劑治療，免疫調(diào)節(jié)治療(如β-干擾素、芬戈莫德)等，其中芬戈莫徳(FTY-720)在2010年9月成為首個(gè)被美國食品與藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)用于治療復(fù)發(fā)型多發(fā)性硬化癥(Relapsing-remitting multiple sclerosis,RRMS)的口服免疫抑制劑，F(xiàn)TY-720在MS的治療中的主要機(jī)制是在體內(nèi)磷酸化后，作為1-磷酸鞘氨醇(Sphingosine-1-phosphate,S1P)受體調(diào)節(jié)劑，通過與T淋巴細(xì)胞表達(dá)的鞘氨醇-1-磷酸1型受體(Sphingosine-1-phosphate receptor 1)結(jié)合，促使外周循環(huán)中T淋巴細(xì)胞歸巢，以減少T淋巴細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中的破壞性浸潤[2]。大量研究表明S1P/S1PR1信號(hào)通路在T淋巴細(xì)胞成熟、歸巢以及遷移中具有核心作用[3]。因此以S1P/S1PR1信號(hào)通路上下游為靶向目標(biāo)的藥物研究也是目前的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)選用病理特征、生化指標(biāo)、臨床癥狀與MS相似的實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)小鼠作為動(dòng)物模型[4]，經(jīng)外周轉(zhuǎn)染攜帶目的基因S1PR1的慢病毒(LV-S1PR1)，通過觀察小鼠臨床癥狀、脾臟中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例及脊髓組織中炎癥因子表達(dá)的水平，探討外周轉(zhuǎn)染LV-S1PR1對(duì)EAE小鼠發(fā)病的影響及產(chǎn)生該影響可能的機(jī)制，期望為S1P/S1PR1信號(hào)通路中靶向藥物的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)及新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)健康雌性C57BL/6小鼠30只,購自重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司,生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(渝)2018-0003，周齡介于6～8周，體重16～20 g，所有小鼠飼養(yǎng)于溫度22～26℃，相對(duì)濕度 40%～80%，明暗交替12 h的環(huán)境中，以潔凈飲水和標(biāo)準(zhǔn)飼料自由飲食，實(shí)驗(yàn)過程符合《實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物飼養(yǎng)和操作條例》。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白35-55(MOG35-55)(上海吉爾生化公司)，完全弗氏佐劑(CFA)、百日咳毒素(PTX)(美國Sigma公司)，卡介苗(Dfico公司)，S1PR1基因慢病毒(LV-S1PR1)(上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)公司，合同編號(hào)GCPL0142868)，兔抗鼠S1PR1抗體、兔抗鼠GAPDH抗體(英國Abcam公司)，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔抗體(美國KPL公司)，S1P、IFN-γ、IL-17 ELISA檢測(cè)試劑盒(武漢科鹿生物科技有限責(zé)任公司)，APC-CD3、PE-CD4(美國Biolegend公司)；臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，流式細(xì)胞儀(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)等。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組、EAE模型建立及LV-S1PR1轉(zhuǎn)染方法 將30只C57BL/6雌性小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、EAE模型組及LV-S1PR1轉(zhuǎn)染組，每組各10只。EAE模型組及LV-S1PR1轉(zhuǎn)染組小鼠采用MOG35-55多肽免疫法制備EAE模型，用PBS(0.01 mol/ml，pH7.2)將抗原MOG35-55稀釋為3 mg/ml，加入等體積完全弗氏佐劑(CFA)，其中卡介苗的濃度為10 g/ml，用注射器于冰上持續(xù)抽打乳化至油包水狀態(tài)，在小鼠脊柱兩側(cè)、頸部、蹊部四個(gè)點(diǎn)皮下注射抗原乳劑0.2 ml/只，免疫后0 h及48 h腹腔注射百日咳毒素(PTX)500 ng/只，對(duì)照組注射同等體積生理鹽水。以免疫當(dāng)天為第0天，免疫后第3天LV-S1PR1轉(zhuǎn)染組10只小鼠通過尾靜脈注射LV-S1PR1，病毒滴度為8×108TU/ml，10 μl/只，空白對(duì)照組及EAE模型組尾靜脈注射同等體積的生理鹽水。

1.2.2 神經(jīng)功能缺損評(píng)分 第0天開始至第28天每日同一時(shí)間(上午10:00)由同一人觀察各組小鼠的攝食情況、臨床癥狀，并采用雙盲法進(jìn)行各組小鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分，0分:不發(fā)病，無臨床癥狀；1分:尾部張力降低；2分:尾部麻痹拖地、雙后肢輕微無力；3分:雙后肢嚴(yán)重?zé)o力；4分:四肢癱瘓；5分:瀕死狀態(tài)或發(fā)病后死亡。

1.2.3 各組小鼠外周血中S1PR1表達(dá)的檢測(cè) 第28天，用10%水合氯醛麻醉小鼠后行眼球取血，使血液自然流出以防止凝血，加入冷卻的PBS緩沖液低速離心收集細(xì)胞沉淀，依次加入蛋白酶抑制劑、細(xì)胞總蛋白提取試劑后冰浴30 min，再次離心收集上清，完成外周血懸浮細(xì)胞總蛋白提取，使用BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)樣品的濃度，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，將轉(zhuǎn)好的膜加入封閉液室溫封閉1 h后加入1∶1 000稀釋的一抗(兔抗鼠S1PR1)4℃過夜，回收稀釋的一抗并用TBST洗3次，加入1∶5 000稀釋的二抗(HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG)，室溫孵育30 min后用TBST在搖床上洗4次，將新鮮配制的ECL混合溶液滴在膜的蛋白面?zhèn)?，于暗室中曝光，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光和成像，用 Alpha Ease FC 軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值。使用GAPDA作為內(nèi)參，蛋白的相對(duì)表達(dá)量用目的蛋白S1PR1 OD/GAPDH OD表示。

1.2.4 各組小鼠外周血中S1P水平的檢測(cè) 用1.5 ml 滅菌EP管收集1.2.3中各組小鼠血液樣本，室溫放置1 h待血液凝固后，4℃ 12 000 r/min離心15 min，收集上層血清，-20℃保存?zhèn)溆?。按照ELISA試劑盒說明書的操作檢測(cè)各組小鼠外周血中S1P的水平。

1.2.5 各組小鼠脊髓組織中IL-17、IFN-γ水平的檢測(cè) 完成眼球取血后的小鼠立即斷頭處死，在冰盤上快速分離脊髓組織，將分離得到的脊髓組織凍于液氮保存、備用。按照ELISA試劑盒說明書的操作檢測(cè)各組小鼠脊髓組織中IL-17、IFN-γ水平。

1.2.6 各組小鼠脾臟中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例測(cè)定 分離取出小鼠脾臟，于細(xì)胞篩上碾碎、研磨，離心后制成單細(xì)胞懸液，每個(gè)流式樣管中收集1×106個(gè)細(xì)胞，加入APC-CD3、PE-CD4抗體標(biāo)記細(xì)胞，4℃避光保存孵育30 min后向管中加入200 μl PBS后上機(jī)，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，并用FlowJo軟件分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠神經(jīng)功能缺損癥狀評(píng)價(jià) 如圖1所示，正常對(duì)照組小鼠未發(fā)病，飲食活動(dòng)正常，體重持續(xù)增加。EAE模型組和LV-S1PR1轉(zhuǎn)染組小鼠均不同程度的發(fā)病，免疫后10 d開始，EAE組和LV-S1PR1轉(zhuǎn)染組小鼠開始出現(xiàn)體重減輕、精神萎靡、活動(dòng)減少；12 d開始，EAE組和LV-S1PR1轉(zhuǎn)染組小鼠陸續(xù)發(fā)病，主要表現(xiàn)為尾部張力下降、單側(cè)后肢無力，以上癥狀在15～26 d加重，逐漸開始出現(xiàn)尾部拖地、一側(cè)肢體癱瘓或四肢癱瘓，甚至出現(xiàn)瀕死狀態(tài)；而LV-S1PR1轉(zhuǎn)染組小鼠在18～24 d上述神經(jīng)功能缺損癥狀評(píng)分較EAE組下降，EAE模型組和LV-S1PR1轉(zhuǎn)染組小鼠發(fā)病的潛伏期、進(jìn)展期的比較以及發(fā)病高峰期神經(jīng)功能缺損評(píng)分結(jié)果見表1。

2.2 各組小鼠外周血中S1PR1表達(dá)水平的比較 使用GAPDA作為內(nèi)參，空白對(duì)照組、EAE模型組、LV-S1PR1轉(zhuǎn)染組小鼠外周血中S1PR1的相對(duì)表達(dá)量S1PR1/GAPDH分別為0.57±0.07、0.08±0.01、0.32±0.08。EAE模型組小鼠外周血中S1PR1蛋白相對(duì)表達(dá)量低于空白對(duì)照組(P<0.05)，低于LV-S1PR1轉(zhuǎn)染組(P<0.05)；LV-S1PR1轉(zhuǎn)染組小鼠外周血中S1PR1蛋白相對(duì)表達(dá)量低于空白對(duì)照組(P<0.05)，高于EAE模型組(P<0.05)。見圖2。

2.3 各組小鼠外周血中S1P水平的比較 空白對(duì)照組、 EAE模型組、LV-S1PR1轉(zhuǎn)染組小鼠外周血中S1P的水平分別為(26.62±6.15)、(90.77±11.3)、(55.31±7.87)ng/ml。EAE模型組小鼠外周血中S1P的水平高于空白對(duì)照組(P<0.05)，高于LV-S1PR1轉(zhuǎn)染組(P<0.05)；LV-S1PR1轉(zhuǎn)染組小鼠外周血中S1P的水平高于空白對(duì)照組(P<0.05)，低于EAE模型組(P<0.05)。

圖1 神經(jīng)功能缺損評(píng)分變化示意圖Fig.1 Schematic diagram of changes in neurological deficit scores

2.4 各組小鼠脊髓組織中IL-17、IFN-γ水平的比較 如表2所示，EAE模型組小鼠脊髓組織中炎癥因子IL-17、IFN-γ水平均高于空白對(duì)照組(P<0.05)，高于LV-S1PR1轉(zhuǎn)染組(P<0.05)；LV-S1PR1轉(zhuǎn)染組小鼠脊髓組織中IL-17、IFN-γ水平均高于空白對(duì)照組(P<0.05)，低于EAE模型組(P<0.05)。

2.5 各組小鼠脾臟中調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞比例的檢測(cè) 空白對(duì)照組、EAE模型組、LV-S1PR1轉(zhuǎn)染組小鼠脾臟中調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞所占比例分別為(44.03±2.45)%、(64.87±2.81)%、(53.13±2.94)%。EAE模型組小鼠脾臟中的調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞比例高于空白對(duì)照組(P<0.05)和LV-S1PR1轉(zhuǎn)染組(P<0.05)；LV-S1PR1轉(zhuǎn)染組小鼠脾臟中的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例高于空白對(duì)照組(P<0.05)，低于EAE模型組(P<0.05)。見圖3。

GroupsIncubationperiod(d)Progressperiod(d)Neurologicaldeficit scores inpeak onset periodEAE model group10.10±1.2010.00±1.163.13±0.33LV-S1PR1 transfection group15.80±1.691)7.50±1.431)2.03±0.311)

Note：Compared with EAE model group，1)P<0.01.

圖2 各組小鼠外周血中S1PR1表達(dá)水平的比較Fig.2 Comparison of S1PR1 expression levels in peripheral blood of mice in each groupNote: A.Blank control group;B.EAE model group;C.LV-S1PR1 transfection group.

GroupsIL-17(pg/ml)IFN-γ(pg/ml)Blank control group26.46±0.7520.86±2.68EAE model group64.05±0.951)47.49±2.071)LV-S1PR1 transfection group41.36±2.271)2)27.53±2.31)2)F814.311172.204P<0.001<0.001

Note：Compared with blank control group，1)P<0.05；Compared with EAE model group，2)P<0.05.

圖3 各組小鼠脾臟中調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞流式細(xì)胞圖Fig.3 Flow cytometry of regulatory T lymphocytes in spleens of mice in each groupNote: A.Blank control group;B.EAE model group;C.LV-S1PR1 transfection group.

3 討論

MS的病因及具體發(fā)病機(jī)制至今尚未明確，但大量的研究已經(jīng)證實(shí)，在T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)下中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system,CNS)發(fā)生慢性炎性脫髓鞘改變是MS的主要發(fā)病機(jī)制[5]。隨著進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)T淋巴細(xì)胞從淋巴器官、外周循環(huán)逐級(jí)遷移至CNS，最終介導(dǎo)CNS炎癥反應(yīng)發(fā)生，這一復(fù)雜過程中，S1P濃度梯度以及S1P/S1PR1之間的相互作用發(fā)揮著核心作用[3]。S1P是一種重要的內(nèi)源性磷脂分子[6]，在體內(nèi)經(jīng)鞘氨醇激酶1～2(Sphingosine kinase 1-2,SPHK1-2)磷酸化后生成，S1P通過與五種G蛋白偶聯(lián)受體(S1PR1～S1PR5)結(jié)合，在免疫系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)的正常生理和相關(guān)疾病發(fā)展過程中具有重要的調(diào)節(jié)功能[7-11]，而S1PR1表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、星型膠質(zhì)細(xì)胞等。由于外周循環(huán)中的細(xì)胞缺乏1-磷酸鞘氨醇磷酸酶(S1P phosphatase,S1Pase)和1-磷酸鞘氨醇裂解酶(S1P lyase)兩種降低S1P濃度水平的酶，因此外周循環(huán)中有著較高的S1P水平，造成胸腺、脾臟以及其他次級(jí)淋巴器官與外周循環(huán)之間存在著S1P水平梯度[12]。在MS的發(fā)病過程中，T淋巴細(xì)胞表面表達(dá)的S1PR1受到外周循環(huán)中高濃度水平的S1P吸引，由淋巴組織向外周循環(huán)逐漸遷移至CNS，最終介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。由于S1P/S1PR1信號(hào)通路在免疫系統(tǒng)疾病中發(fā)揮著重要生物學(xué)效應(yīng)，目前選擇性S1PR1調(diào)節(jié)劑、SPHK抑制劑和 S1P裂解酶抑制劑等多種以S1P/S1PR1信號(hào)通路上下游為靶向目標(biāo)的藥物正在研發(fā)過程中，以S1PR1調(diào)節(jié)劑的研究較為多見，而對(duì)于外周循環(huán)中總細(xì)胞S1PR1表達(dá)上調(diào)對(duì)EAE小鼠發(fā)病的影響及其作用機(jī)制的研究尚無報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)經(jīng)EAE小鼠尾靜脈轉(zhuǎn)染攜帶目的基因S1PR1的慢病毒，通過觀察EAE小鼠的臨床癥狀、脾臟調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例及脊髓組織炎癥因子的表達(dá)水平，初步探討S1PR1基因轉(zhuǎn)染對(duì)EAE小鼠發(fā)病的影響及其可能的機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LV-S1PR1轉(zhuǎn)染組小鼠與EAE模型組小鼠相比較，LV-S1PR1轉(zhuǎn)染組小鼠發(fā)病的潛伏期延長(zhǎng)，進(jìn)展期縮短，LV-S1PR1轉(zhuǎn)染組小鼠發(fā)病高峰期時(shí)神經(jīng)功能缺損評(píng)分較EAE模型組降低，提示外周轉(zhuǎn)染LV-S1PR1對(duì)EAE小鼠的發(fā)病有防治作用。已有實(shí)驗(yàn)表明，在SPHK缺陷小鼠的血中不能檢測(cè)到S1P的存在，外周血與胸腺之間的S1P濃度梯度改變，T淋巴細(xì)胞從胸腺遷出的過程嚴(yán)重受阻，當(dāng)SPHK缺陷小鼠獲得野生型小鼠骨髓后，外周血中S1P水平恢復(fù)，T淋巴細(xì)胞重新獲得遷出胸腺的能力[13]。雖然目前T淋巴細(xì)胞從胸腺以及脾臟遷出的具體動(dòng)力學(xué)過程尚未明確，但基于已有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知外周血與淋巴器官之間的S1P濃度差是T淋巴細(xì)胞向外周遷移的必要條件。本實(shí)驗(yàn)觀察到，LV-S1PR1轉(zhuǎn)染組小鼠外周循環(huán)中S1PR1表達(dá)高于EAE模型組，而LV-S1PR1轉(zhuǎn)染組小鼠外周血中S1P水平較EAE模型組小鼠降低，其機(jī)制可能是由于LV-S1PR1轉(zhuǎn)染組上調(diào)了外周循環(huán)中S1PR1的表達(dá)，S1PR1與S1P結(jié)合，從而使S1P水平下降。同時(shí)，LV-S1PR1轉(zhuǎn)染組小鼠脾臟中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例較EAE模型組降低，其主要機(jī)制可能是LV-S1PR1轉(zhuǎn)染組小鼠外周血S1P水平較EAE模型組降低，使外周循環(huán)與淋巴器官之間S1P濃度差減小，導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞遷出胸腺向外周循環(huán)遷移的過程受阻，最終LV-S1PR1轉(zhuǎn)染組小鼠脾臟中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例下降。而調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞在炎癥反應(yīng)及自身免疫疾病中發(fā)揮重要的生物學(xué)效應(yīng)，CD4+T細(xì)胞可以分化為Th1、Th17細(xì)胞，而Th1、Th17細(xì)胞可以分泌IL-17、IFN-γ等炎癥因子，上述炎癥因子在CNS中可以激活周圍的星型膠質(zhì)細(xì)胞等神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分泌促炎癥因子和趨化因子，使更多的炎癥細(xì)胞經(jīng)血腦屏障進(jìn)入CNS導(dǎo)致慢性脫髓鞘的發(fā)生[14]。已有研究發(fā)現(xiàn)，Th17細(xì)胞可以直接入侵CNS，主要機(jī)制是Th17細(xì)胞作用于內(nèi)皮細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞后加速了血腦屏障的破壞[15]。本實(shí)驗(yàn)中，LV-S1PR1轉(zhuǎn)染組小鼠脊髓組織中炎癥因子IL-17、IFN-γ水平均低于EAE模型組，可能與LV-S1PR1轉(zhuǎn)染組T淋巴細(xì)胞遷移受阻、脾臟調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞比例下降，最終減少了IL-17、IFN-γ的釋放有關(guān)。

在本實(shí)驗(yàn)中我們觀察到，各組小鼠的神經(jīng)缺損癥狀的嚴(yán)重程度、脊髓組織中炎癥因子的表達(dá)水平以及脾臟中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞所占比例，都與外周血S1P的水平相關(guān)，EAE模型組和LV-S1PR1轉(zhuǎn)染組小鼠外周血中S1P水平均較正常對(duì)照組增高，不同程度地出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損的臨床癥狀，脊髓組織中炎癥因子表達(dá)以及脾臟中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例增高；LV-S1PR1轉(zhuǎn)染組小鼠外周血中S1P水平較EAE模型組下降，上述觀察指標(biāo)均有一定程度的改善。此外，有研究發(fā)現(xiàn)MS患者腦脊液中S1P水平較正常人增高，提出S1P可能具有較強(qiáng)的促炎活性以及促進(jìn)星型膠質(zhì)細(xì)胞增生的作用[16]。本實(shí)驗(yàn)中，LV-S1PR1轉(zhuǎn)染組小鼠S1P水平較EAE組下降，通過減輕LV-S1PR1轉(zhuǎn)染組小鼠CNS中炎癥反應(yīng)以及星型膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生，最終減輕CNS損傷，可能是外周轉(zhuǎn)染LV-S1PR1改善EAE小鼠發(fā)病的一個(gè)重要機(jī)制。在T淋巴細(xì)胞從胸腺向外周循環(huán)、CNS遷移的過程中，T細(xì)胞S1PR1的表達(dá)以及S1P濃度梯度為兩個(gè)必不可少的條件，本實(shí)驗(yàn)通過外周轉(zhuǎn)染LV-S1PR1，上調(diào)外周循環(huán)中各細(xì)胞S1PR1的表達(dá)，一方面，外周中的T細(xì)胞S1PR1表達(dá)上調(diào)，將促進(jìn)T細(xì)胞向CNS遷移，加重CNS炎癥反應(yīng)；另一方面，外周循環(huán)中各細(xì)胞增加表達(dá)的S1PR1與S1P結(jié)合，使循環(huán)中S1P水平下降，破壞T細(xì)胞向外周循環(huán)遷移的初始動(dòng)力，使T細(xì)胞受困于胸腺等淋巴器官，將減輕炎癥細(xì)胞在CNS的破壞性浸潤，改善EAE小鼠的臨床癥狀。從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以得出，在T細(xì)胞的遷移過程中，S1P的濃度梯度比T細(xì)胞表達(dá)S1PR1上調(diào)可能發(fā)揮更核心的作用，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，經(jīng)外周轉(zhuǎn)染LV-S1PR1后EAE小鼠神經(jīng)功能缺損癥狀改善，對(duì)EAE小鼠的發(fā)病具有防治作用，其主要機(jī)制可能是通過上調(diào)外周循環(huán)中S1PR1的表達(dá)，結(jié)合S1P后使S1P水平下降，打破淋巴器官與外周循環(huán)之間S1P濃度差，使T淋巴細(xì)胞向外周循環(huán)遷移的初始動(dòng)力減弱、遷移受阻，最終減輕CNS炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)觀察到S1P水平在EAE發(fā)病過程中的重要生物學(xué)效應(yīng)，使其在MS以及其他自身免疫性疾病中可能成為一種具有巨大潛力的治療靶點(diǎn)，更有望成為評(píng)估疾病活動(dòng)程度、治療進(jìn)展的一種生物標(biāo)志物，對(duì)S1P/S1PR1信號(hào)通路中靶向藥物的研發(fā)提供新的思路。