1株苧麻生防內(nèi)生細(xì)菌的分離鑒定及抑菌能力

孫向平 陳夢(mèng)雅 張夢(mèng)君

摘要：國(guó)內(nèi)外關(guān)于苧麻的研究主要集中在作物栽培、高產(chǎn)育種、副產(chǎn)物多用途等，內(nèi)生細(xì)菌的研究還比較少。利用表面消毒和組織分離法從苧麻的葉部篩選出1株生防內(nèi)生細(xì)菌，通過(guò)平板對(duì)峙試驗(yàn)測(cè)定它對(duì)苧麻白紋羽病病菌、油茶炭疽病病菌、黃瓜枯萎病病菌的抑制率。結(jié)果表明，該內(nèi)生細(xì)菌對(duì)苧麻白紋羽病病菌、油茶炭疽病病菌、黃瓜枯萎病病菌具有很好的拮抗作用，抑制率分別達(dá)到53.6%、42.1%、34.8%。通過(guò)16S rDNA測(cè)序、Blast同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，其與芽孢桿菌同源性最高。結(jié)合生理生化指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果，初步判定該菌株為蠟樣芽孢桿菌。試驗(yàn)結(jié)果為對(duì)其生防機(jī)制的研究奠定了很好的基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：苧麻;內(nèi)生細(xì)菌;分離鑒定;生物防治;蠟樣芽孢桿菌

中圖分類(lèi)號(hào)： S182 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）02-0087-04

苧麻[Boehmeria nivea （L.） Gaud]為蕁麻科（Urticaceae）苧麻屬（Boehmeria）多年生宿根性草本植物，別稱(chēng)銀苧、苧根、山麻、天青地白草等，是一種重要的韌皮纖維作物，也是我國(guó)傳統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)特產(chǎn)，在國(guó)外被稱(chēng)作“中國(guó)草”[1]。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于苧麻的研究主要集中在苧麻生理栽培、分子育種等方面，國(guó)內(nèi)外關(guān)于苧麻內(nèi)生菌的研究還比較少[2]。植物內(nèi)生菌是指其生活史的一定階段或全部階段生活在健康植物各種組織器官內(nèi)部或組織間隙中的微生物[3]，是目前已被廣泛研究的一種微生物資源[4]。

內(nèi)生菌存在于植物的器官內(nèi)，如植物的根、莖、葉、花、果實(shí)。每一種植物內(nèi)存在的內(nèi)生菌種類(lèi)、數(shù)量與植物的種類(lèi)、生存環(huán)境、生長(zhǎng)階段、基因型以及營(yíng)養(yǎng)的供給是否能滿(mǎn)足其生長(zhǎng)有緊密的聯(lián)系[5]。而且相同的植物生長(zhǎng)在不同的地區(qū)和不同的生活環(huán)境，其相同的組織中生長(zhǎng)的內(nèi)生菌種類(lèi)和數(shù)量也有著明顯的差異，即便在同一地區(qū)，同一植物不同生長(zhǎng)部位的植物內(nèi)生菌的類(lèi)群和數(shù)量也不一樣[6]。目前，已經(jīng)報(bào)道的內(nèi)生細(xì)菌大多數(shù)為固氮菌屬（Diazotrophicus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、 假單胞菌屬（Pseudomonas）、土壤桿菌屬（Agrobacterium）、泛菌屬（Pantoea）等[7]。

由于許多拮抗微生物同時(shí)具有對(duì)作物促生的作用，能兼治植物病害和環(huán)境污染等特點(diǎn)，引起越來(lái)越多的關(guān)注和重視[8]。因此，利用植物內(nèi)生菌防治植物病原菌已經(jīng)成為目前內(nèi)生菌研究的熱點(diǎn)[5]。本研究從苧麻葉部分離出1株具有生防作用的內(nèi)生細(xì)菌，利用常規(guī)理化性質(zhì)及分子生物學(xué)手段對(duì)其進(jìn)行菌株鑒定，并挖掘其生防潛力，以期豐富實(shí)驗(yàn)室生防菌種資源。

1 材料與方法

1.1 內(nèi)生細(xì)菌的分離和保存

2015年12月至2016年12月選取中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類(lèi)研究所培育的中苧1號(hào)苧麻新品種在湖南省益陽(yáng)市沅江試驗(yàn)基地進(jìn)行栽培，2016年6月上旬取頭麻成熟期生長(zhǎng)良好、無(wú)病害的健康植株樣品，放入樣品袋中帶回實(shí)驗(yàn)室。將植物樣品清洗干凈放置于通風(fēng)陰涼處，使其表面水分蒸發(fā)干燥，將苧麻進(jìn)行根、莖、葉分離后立即進(jìn)行內(nèi)生菌的分離篩選。細(xì)菌培養(yǎng)采用營(yíng)養(yǎng)瓊脂 （nutrient agar，簡(jiǎn)稱(chēng)NA） 培養(yǎng)基：牛肉膏 3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂15.0～20.0 g，pH值為7.0～7.2，121 ℃高壓滅菌15 min。根、莖、葉內(nèi)生細(xì)菌的合適消毒藥劑及消毒時(shí)間分別為2%次氯酸消毒2 min、0.1%硝酸消毒1 min、2%高錳酸消毒2 min。

在無(wú)菌操作下挑選出平板上形態(tài)、顏色、大小各異的菌落，單獨(dú)置于LB培養(yǎng)基上劃線(xiàn)培養(yǎng)，用封口膠帶包好置于 30 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～24 h，觀(guān)察細(xì)菌生長(zhǎng)情況，若依然有不同形態(tài)菌落，繼續(xù)進(jìn)行平板畫(huà)線(xiàn)培養(yǎng)直到分離出單一的菌落。

1.2 供試病原菌和培養(yǎng)基

試驗(yàn)中供抗菌譜測(cè)定用植物病原菌包括苧麻白紋羽病病菌（Rosellinia necatrix）、黃瓜枯萎病病菌（Fusarium oxysporum sp. cucumebrium Owen）、油茶炭疽病病菌（Colletotrichum camelliae Massee）。

真菌培養(yǎng)基采用馬鈴薯葡萄糖（potato dextrose agar，簡(jiǎn)稱(chēng)PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮）200 g，葡萄糖（或蔗糖）20 g，瓊脂15～20 g，pH值自然，121 ℃高壓滅菌15 min。將實(shí)驗(yàn)室保存純化的多種病原菌的菌餅（0.8 mm）放于PDA培養(yǎng)基平板中央，對(duì)照設(shè)置為空白PDA培養(yǎng)基;將接種好的培養(yǎng)基放在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，當(dāng)病原菌菌絲長(zhǎng)至1 cm左右，用滅菌的牙簽蘸取培養(yǎng)2 d的內(nèi)生細(xì)菌單菌落，分別在距離病原菌 2.5 cm 處4點(diǎn)等距離對(duì)稱(chēng)地點(diǎn)接，以只接種了植物病原菌的培養(yǎng)基為對(duì)照組，接完后用封口膠帶將培養(yǎng)基封好，放入 30 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 內(nèi)生菌的拮抗作用鑒定

其中真菌性病原菌以PDA培養(yǎng)基進(jìn)行對(duì)峙試驗(yàn)，測(cè)定抑菌圈直徑。抑菌活性用抑菌圈直徑（mm）表示，抑菌圈直 徑= 透明圈直徑-孔徑（8 mm）。對(duì)照培養(yǎng)的病原菌的菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)平皿，觀(guān)察、拍照并統(tǒng)計(jì)有拮抗作用的平板，并測(cè)量抑菌圈的大小。

抑制率=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑×100%。

1.4 內(nèi)生菌的生理生化性狀測(cè)定

參考《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[9]以及《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[10]對(duì)苧麻葉內(nèi)生菌Y9菌株的形態(tài)特征、生長(zhǎng)曲線(xiàn)、生理生化指標(biāo)進(jìn)行鑒定。生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定以無(wú)菌的NA培養(yǎng)基為對(duì)照，于30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)，分別于0、6、12、18、24、30、36、48、60、72 h取樣，測(cè)量拮抗菌的D600 nm，繪制菌株生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.5 內(nèi)生菌的16S rDNA基因序列測(cè)定及其分析

采用康為世紀(jì)細(xì)菌基因組提取試劑盒提取內(nèi)生菌基因。PCR引物：25F（5′-AACTKAAGAGTTTGATCCTGGCTC-3′），1492R（5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′）;PCR反應(yīng)體系：10.0 μL Mix，0.5 μL Taq酶，0.5 μL上游引物，0.5 μL下游引物，1.0 μL模板DNA，用ddH2O補(bǔ)足25.0 μL。Mix包括Buffer、dNTP、MgCl2、Taq聚合酶。

PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性50 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán);循環(huán)結(jié)束后 72 ℃ 延伸5 min，12 ℃保溫，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，最終測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast同源性比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌廣譜性

由表1可知，苧麻內(nèi)生細(xì)菌菌株Y9對(duì)苧麻白紋羽病病菌、油茶炭疽病病菌、黃瓜枯萎病病菌均有很好的抑制效果（圖1），其抑制率分別達(dá)到53.6%、42.1%、34.8%，其中對(duì)苧麻白紋羽病病菌的抑制效果最好。

2.2 菌株鑒定

2.2.1 生長(zhǎng)曲線(xiàn)鑒定與菌落形態(tài)特征 苧麻內(nèi)生細(xì)菌Y9菌株的形態(tài)特征表征呈現(xiàn)圓形或不規(guī)則，表面有光澤，透明，沒(méi)有隆起，邊緣整齊，呈乳白色，沒(méi)有氣味，生長(zhǎng)速度正常，具體見(jiàn)圖2。細(xì)菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)是指利用少量的單細(xì)胞微生物接種到三角瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，在不同的時(shí)間點(diǎn)測(cè)定其D600 nm來(lái)描述細(xì)菌的生長(zhǎng)代謝周期。苧麻內(nèi)生細(xì)菌Y9菌株的生長(zhǎng)曲線(xiàn)見(jiàn)圖3，菌株Y9的生長(zhǎng)周期為48 h，其中對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期在4～12 h之間。

2.2.2 生理生化特征測(cè)定結(jié)果 由表2可知，苧麻內(nèi)生細(xì)菌Y9菌株的革蘭氏染色呈陽(yáng)性。能利用葡萄糖，接觸酶、甲基紅、VP測(cè)定、硝酸鹽還原的測(cè)定結(jié)果均呈陽(yáng)性，能產(chǎn)氨。吲哚乙酸、產(chǎn)硫化氫、檸檬酸利用、纖維素分解、解磷能力的測(cè)定結(jié)果均呈陰性。

2.2.4 進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果 根據(jù)Blast同源性比對(duì)結(jié)果，對(duì)菌株Y9作進(jìn)化樹(shù)分析。由圖4可知，菌株Y9為芽孢桿菌屬，結(jié)合其理化性質(zhì)，參考《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》及《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，初步判定菌株Y9為蠟樣芽孢桿菌。

3 結(jié)論與討論

內(nèi)生菌在不表現(xiàn)外在感染癥狀的健康植物組織內(nèi)部生長(zhǎng)，因此它的存在和作用一直以來(lái)容易被人們忽視。近年來(lái)研究表明，植物體內(nèi)存在大量的對(duì)植物病原菌具有較好拮抗作用的內(nèi)生菌。因此，從植物中分離內(nèi)生菌和尋找具有良好生防效果的菌株備受關(guān)注[8]。內(nèi)生菌是目前不可多得的天然微生物資源，它具有廣闊的研究和開(kāi)發(fā)空間，可用于活性物質(zhì)生產(chǎn)、經(jīng)濟(jì)作物種植、環(huán)境保護(hù)、衛(wèi)生保健等各個(gè)方面[5，11]。研究表明，植物內(nèi)生菌能夠生活于植物體內(nèi)的各個(gè)組織中，還可以在植物體內(nèi)長(zhǎng)期定殖并傳導(dǎo)，不容易受環(huán)境等各個(gè)方面的影響。內(nèi)生細(xì)菌作為生防菌發(fā)揮作用時(shí)有許多制約因素，除內(nèi)生細(xì)菌的生防機(jī)制和轉(zhuǎn)運(yùn)外，植物的栽培條件、栽培措施，自然環(huán)境，微生態(tài)環(huán)境，細(xì)菌的形態(tài)穩(wěn)定性等都影響內(nèi)生細(xì)菌發(fā)揮作用[12-13]。

本研究經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的表面消毒程序，從健康的苧麻葉組織中分離得到1株對(duì)苧麻白紋羽病病菌、油茶炭疽病病菌、黃瓜枯萎病病菌有較強(qiáng)拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌，通過(guò)對(duì)其形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化特征測(cè)定，結(jié)合16S rDNA序列分析，初步鑒定為蠟樣芽孢桿菌，為進(jìn)一步開(kāi)展其生防機(jī)制的研究提供了基礎(chǔ)。目前主要應(yīng)用的芽孢桿菌活菌制劑有蠟樣芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌等[14-15]。有研究表明，蠟樣芽孢桿菌可以降解血紅蛋白[16]，蠟樣芽孢桿菌BC98-Ⅰ發(fā)酵液與其抑菌粗提物對(duì)黃瓜枯萎病具有良好的抑制作用，使孢子萌發(fā)率降低、菌絲生長(zhǎng)異常，且抑菌特性穩(wěn)定，對(duì)外界環(huán)境有很強(qiáng)的耐受性和適用性[17]。芽孢桿菌作為土壤和植物微生態(tài)優(yōu)勢(shì)種群之一，其抗逆性較強(qiáng)，同時(shí)能夠產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)，目前已在農(nóng)作物病蟲(chóng)害生物防治中發(fā)揮了重要作用[18-20]。

本研究從苧麻上獲得了1株對(duì)苧麻白紋羽病病菌、油茶炭疽病病菌、黃瓜枯萎病病菌具有良好拮抗效果的內(nèi)生細(xì)菌，抑制率分別達(dá)到53.6%、42.1%、34.8%。根據(jù)其生理生化特征，參考《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》及《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，結(jié)合16S rDNA測(cè)定結(jié)果，初步將該內(nèi)生細(xì)菌鑒定為蠟樣芽孢桿菌。該菌株具有一定的研發(fā)潛力，但其生物學(xué)特性、生防機(jī)制、發(fā)酵條件等還有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]成雄偉. 我國(guó)苧麻紡織工業(yè)歷史現(xiàn)狀及發(fā)展[J]. 中國(guó)麻業(yè)科學(xué)，2007，29（增刊1）：77-85.

[2]孫向平，陳夢(mèng)雅，曾糧斌，等. 不同消毒劑對(duì)苧麻各器官內(nèi)生菌分離效果的影響[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016（12）：10-11，14.

[3]Stone J K，Bacon C W，White J J. An overview of endophytic microbes：endophytism defined[M]. New York：Marcel Dekker，2000：3-29.

[4]任安芝，高玉葆. 植物內(nèi)生真菌——一類(lèi)應(yīng)用前景廣闊的資源微生物[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，2001，28（6）：90-93.

[5]李 強(qiáng)，劉 軍，周東坡，等. 植物內(nèi)生菌的開(kāi)發(fā)與研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，2006（3）：33-37.

[6]周俊萍，楊本壽，代 嬌. 植物內(nèi)生菌的生物學(xué)作用及應(yīng)用前景[J]. 曲靖師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2016，35（3）：35-40.

[7]Zhao L F，Xu Y J，Sun R，et al. Identification and characterization of the endophytic plant growth prompter Bacillus cereus strain mq23 isolated from Sophora alopecuroides root nodules[J]. Brazilian Journal of Microbiology，2011，42（2）：567-575.

[8]黃敬瑜，張楚軍，姚瑜龍，等. 植物內(nèi)生菌生物抗菌活性物質(zhì)研究進(jìn)展[J]. 生物工程學(xué)報(bào)，2017，33（2）：178-186.

[9]東秀珠，蔡妙英. 常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M]. 北京：科學(xué)出版社，2001：353-391.

[10]布坎南·吉本斯. 伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)[M]. 8版. 北京：科學(xué)出版社，1984.

[11]曹 晨，劉寶林. 內(nèi)生菌EJS-1和EMD-1菌株發(fā)酵液抗菌譜的研究[J]. 上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009，25（3）：75-78.

[12]孔慶科，丁愛(ài)云. 內(nèi)生細(xì)菌作為生防因子的研究進(jìn)展[J]. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2001，32（2）：256-260.

[13]殷曉敏，陳 弟，吳紅萍，等. 一株對(duì)香蕉枯萎病菌具有良好拮抗作用的菊歐氏桿菌[J]. 中國(guó)生物防治，2009，25（1）：60-65.

[14]劉國(guó)紅，林乃銓?zhuān)譅I(yíng)志，等. 芽孢桿菌分類(lèi)與應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，23（1）：92-99.

[15]Swain M R，Ray R C. Biocontrol and other beneficial activities of Bacillus subtilis isolated from cowdung microflora[J]. Microbiological Research，2009，164（2）：121-130.

[16]張 濱，馬美湖. 蠟狀芽孢桿菌（B. cereus）對(duì)血紅蛋白（Hb）降解特性研究[J]. 肉品衛(wèi)生，2005（7）：18-22.

[17]高 芬，馬利平，喬雄梧，等. 蠟質(zhì)芽孢桿菌BC98-Ⅰ發(fā)酵液與抑菌粗提物對(duì)黃瓜枯萎病菌的抑菌特性研究[J]. 中國(guó)生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2006，14（1）：189-192.

[18]Branda S S，Chu F，Kearns D B，et al. A major protein component of the Bacillus subtilis biofilm matrix[J]. Molecular Microbiology，2006，59（4）：1229-1238.

[19]Chu F，Kearns D B，Branda S S，et al. Targets of the master regulator of biofilm formation in Bacillus subtilis[J]. Molecular Microbiology，2006，59（4）：1216-1228.

[20]楊麗榮，王正軍，薛保國(guó)，等. 解淀粉芽孢桿菌YN-1抑菌蛋白TasA基因的克隆及原核表達(dá)[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2010，29（5）：823-828.