白藜蘆醇對人結腸細胞NCM460和SW620增殖及基因組不穩(wěn)定性的影響

曹 宇，張喬曄，花 蕊，馬曉玲，汪 旭，3，倪 娟 ，3，*

(1.云南師范大學生命科學學院，云南 昆明650500；2.上海三譽華夏基因科技有限公司，上海 201101；3.云南師范大學生物能源持續(xù)開發(fā)與利用教育部工程研究中心，云南 昆明 650500)

基因組不穩(wěn)定性(genomicinstability，GIN)是眾多人類遺傳-環(huán)境疾病的基礎誘因，其與出生缺陷、免疫缺陷和退行性疾病(如老年性癡呆、心血管疾病、腫瘤等)危險度增加高度相關[1-3]。GIN少量增加可以誘發(fā)細胞周期停滯，使細胞對受損基因組進行修復。當細胞出現(xiàn)嚴重且不可逆的GIN時，細胞便會出現(xiàn)生存劣勢，最終走向死亡。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，茶多酚和老鸛草素等多酚類物質(zhì)均可通過誘發(fā)高水平的GIN使癌細胞走向凋亡，這可能是其抗癌活性的機制之一[4-5]。

白藜蘆醇(resveratrol，RSV)屬于多酚化合物，存在于幾種天然植物性食品中，包括葡萄、桑葚和花生等。此外，白藜蘆醇的最豐富來源之一是虎杖(Polygonumcuspidatum)，一種在中國傳統(tǒng)醫(yī)學中起重要作用的草藥。RSV實質(zhì)為一種植物抗毒素，由70多種植物產(chǎn)生，以應對壓力等情況感染[6]。Jang等人的一項開創(chuàng)性研究發(fā)現(xiàn)RSV具有抗癌特性[7]，此后大量的體外和體內(nèi)研究表明，RSV可作為癌癥化學預防劑，并有助于預防與年齡相關的疾病，如心血管疾病、癌癥、骨質(zhì)疏松癥、阿爾茨海默病和糖尿病等[8]。

單個分子如何在多種疾病中發(fā)揮有益效應，其是否通過影響不同類型細胞的GIN進而改變細胞的生長狀況，成為本研究的主要關注點。因此，本研究選用人結腸上皮細胞株NCM460及結腸癌細胞株SW620作為研究對象，探究RSV對兩株細胞GIN及細胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞株及其培養(yǎng)

正常人結直腸上皮細胞株NCM460和人結直腸癌細胞株SW620，均為貼壁上皮細胞，購自中國科學院細胞庫。配制培養(yǎng)基[44.5mLRPMI-1640培養(yǎng)基，5mL新生牛血清，500μLL-谷氨酰胺(l-glutamine，L-Glu)，50μL青霉素/鏈霉素溶液]。用培養(yǎng)基培養(yǎng)NCM460和SW620細胞株，每2～3d更換一次培養(yǎng)基，待細胞鋪滿75%～90%瓶底面積時進行細胞計數(shù)并傳代。

1.2 主要化學試劑

L-Glu、0.25%胰蛋白酶溶液(含EDTA)、新生牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基、青霉素/鏈霉素溶液、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)均購自Gibco公司；二甲基亞砜購自Biosharp公司；RSV粉末購自CaymanChemical公司；0.4%臺盼蘭染液購自Solarbio公司；細胞松弛素B(cytochalasinb，CB)購自Sigma公司；吉姆薩粉末購自上海三思爾公司。

1.3 細胞生長曲線繪制

1.3.1 RSV儲備液配制 10mg的RSV粉末溶解于1 mLDMSO中，配置成43.8mmol/L的儲備液，-20℃保存。

1.3.2 藥物處理 將SW620細胞以4×105/mL的濃度接種至細胞培養(yǎng)24孔板中，37℃、CO2體積分數(shù)為5%的條件下培養(yǎng)，待細胞貼壁后，每孔加入預設濃度(0、3.125、6.25、12.5、25、50、100 μmol/L)的 RSV處理24h。

1.3.3 細胞計數(shù) 藥物處理結束后，棄培養(yǎng)基并用PBS清洗，50μL胰蛋白酶溶液消化后加450μL培養(yǎng)基吹打細胞并混勻，取5μL細胞懸液與5μL0.4%臺盼蘭染液充分混勻，染色2min，取10μL染好的細胞懸液置于血球板計數(shù)活細胞數(shù)量；

1.3.4 計算細胞懸液濃度，繪制生長曲線 計算公式如下：

1.4 胞質(zhì)阻斷分裂微核分析細胞組實驗

1.4.1 藥物處理 將NCM460和SW620細胞分別以3×105個/mL濃度接種到細胞培養(yǎng)12孔板中，37℃、CO2體積分數(shù)為5%的條件下培養(yǎng)，待細胞貼壁后，加入RSV(0，25和100 μmol/L)處理24h。

1.4.2 CB處理 藥物處理結束后，用含有CB的培養(yǎng)基更換掉孔中原有的培養(yǎng)基，培養(yǎng)孔中CB的終濃度為4.5μg/mL，37℃、CO2體積分數(shù)為5%的條件下培養(yǎng)24～28h；

1.4.3 涂片 CB處理結束后，棄培養(yǎng)基并用PBS清洗，50μL胰蛋白酶消化后加200μL培養(yǎng)基吹打細胞并混勻；根據(jù)各孔細胞數(shù)量，取40～100μL的細胞懸液，用涂片離心機制片，800r/min、5min，自然風干后，將片子放入冰甲醇中，固定15min，取出自然風干；將固定好的片子放入吉姆薩工作液中避光染色15～30min，用自來水洗去浮色，自然風干；在涂有細胞的位置滴加中性樹脂，加蓋玻片封片，自然風干。

1.4.4 計數(shù) 在X1000光學顯微鏡下計數(shù)500個細胞中單核、雙核、三核及三核以上的細胞(評判標準為視野內(nèi)，由一個完整的細胞膜包被的等大的界限清晰的著色程度相同的一個或多個細胞核)，及凋亡細胞(評判標準為細胞偽足收縮，體積減小，膜出泡，核高度皺縮，有凋亡小體出現(xiàn)，較正常細胞核著色更深)；1000個含有微核(micronucleus，MN，滿足雙核細胞的條件下，在胞膜范圍內(nèi)，有獨立于雙核之外且與細胞核著色相近或較深的不大于細胞核的1/3的圓形核即為MN)、核質(zhì)橋(nuclearbridge，NPB，滿足雙核細胞的條件下，在胞膜范圍內(nèi)，有連接于雙核之間且與細胞核著色相近或較深的不大于細胞核的1/3的線形物即為NPB)或核芽(nuclearbud，NBud，是MN的前體，滿足MN條件的圓形核經(jīng)由與細胞核著色相近或較深的較細的線形物與核相連，即為NBud)的雙核細胞。以上各指標計數(shù)標準參見圖1。

圖1 CBMN-Cyt實驗中用于判定NDI、GIN和凋亡的各種指標的示意圖

1.4.5 計算細胞核分裂指數(shù) 細胞核分裂指數(shù)(nucleardivisionindex，NDI)的計算公式如下：

(其中 N、M1、M2、M3、Mn分別代表了細胞總數(shù)、單核細胞數(shù)、雙核細胞數(shù)、三核細胞數(shù)及多核細胞數(shù))

1.4.6 計算GIN發(fā)生率 含有各指標的雙核細胞數(shù)量分別除以總雙核細胞數(shù)量可得出細胞MN、NPB或NBud的發(fā)生頻率，三者的頻率相加即為細胞GIN發(fā)生率。

1.4.7 計算細胞凋亡率 凋亡細胞數(shù)除以總細胞數(shù)即為細胞凋亡率。

1.5 集落形成實驗

RSV(0、25和100μmol/L)處理24h后，消化并計數(shù)細胞，從每個孔中取出500個細胞接種至6孔板中，每孔加入2mL正常培養(yǎng)基，37℃、CO2體積分數(shù)為5%的條件下繼續(xù)培養(yǎng)9d，每3d更換一次培養(yǎng)基；9d后，棄掉孔中培養(yǎng)基，用PBS清洗2～3次；冰甲醇固定15min；吉姆薩染料染色15～30min，拍照片記錄并計數(shù)細胞集落數(shù)，使用one-wayANOVA分析白藜蘆醇對細胞集落形成數(shù)的影響。

1.6 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)用SPSS軟件分析，用one-wayANOVA和獨立樣本t檢驗分析處理藥物對各GIN及指標、細胞增殖、NDI、凋亡率及克隆形成數(shù)的影響和差異，且當P＜0.05時具有顯著性差異，使用軟件GraphPadPrism 5.0作圖。

2 結果

2.1 RSV對SW620細胞增殖及GIN的影響

圖2 白藜蘆醇對SW620細胞增殖的影響

細胞生長曲線繪制實驗結果顯示，RSV處理SW620細胞24h后，與0μmol/L對照組相比，6.25～100 μmol/L 可以顯著抑制細胞增殖(圖2，P＜0.05)；100μmol/L可以降低NDI(圖3A，P=0.034)，增加細胞凋亡(圖 3B，P=0.044)和 GIN(圖 3C，P=0.023)，并且MN和NPB的發(fā)生頻率均明顯升高(圖3D，P＜0.05)，提示RSV處理24h可以抑制SW620細胞增殖，增加細胞凋亡，并誘發(fā)高水平的GIN；洗去RSV繼續(xù)培養(yǎng)9 d后，100μmol/L可以顯著降低SW620細胞的集落形成能力(圖4A和B，P=0.000)，顯著增高GIN(圖4C，P＜0.05)，并且MN、NPB和Nbud的發(fā)生頻率均顯著升高(圖4D，P＜0.05)。

圖3 白藜蘆醇作用24h對SW620細胞核分裂指數(shù)、凋亡、GIN及各遺傳損傷指標的影響

圖4 白藜蘆醇作用24h后繼續(xù)培養(yǎng)細胞9d，對SW620細胞集落形成能力、GIN及遺傳損傷指標的影響

2.2 RSV對NCM460細胞GIN和集落形成能力的影響

CBMN-Cyt實驗結果顯示，RSV處理NCM460細胞24h后，25和100μmol/L均可以顯著降低細胞GIN(圖5A，P＜0.05)，增加細胞NDI(圖5B，P＜0.05)；洗去RSV繼續(xù)培養(yǎng)9d后，25和100μmol/L仍然可以降低細胞GIN(圖5C，P＜0.01)，而100 μmol/L還可以增加細胞NDI(圖5D，P=0.034)，并且增強細胞集落形成能力(圖5E和F，P=0.019)。

圖5 白藜蘆醇對NCM460細胞GIN、NDI和集落形成能力的影響

3 討論

高度有序的基因組層級結構極易被外源性或內(nèi)源性的有害物質(zhì)所破壞，出現(xiàn)DNA重排、基因拷貝數(shù)變異、染色體末端融合以及染色體數(shù)目異常(非整倍體)等GIN現(xiàn)象[9]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，個體基因組穩(wěn)定性會隨著年齡的增加顯著下降[10]，成為許多年齡相關疾病，如心血管疾病、癌癥、骨質(zhì)疏松癥、阿爾茨海默病和糖尿病等的重要誘因，EGCG、老鸛草素等多酚類化合物具有維護基因組穩(wěn)定性的效應。

RSV作為一種天然植食性多酚，最卓著的特性是具有較強的抗氧化作用。在自身代謝和外源物質(zhì)暴露下，細胞通常會聚積大量的以活性氧簇(reactive oxygenspecies，ROS)為主的自由基，過高的ROS會作為電子供體對細胞內(nèi)的生物大分子(如DNA)進行氧化修飾和抑制蛋白質(zhì)功能，短期內(nèi)可顯著增加雙鏈DNA斷裂、染色體末端融合、染色體易位和重排[11]以及促進細胞死亡[12]，長期存在則會促進腫瘤發(fā)生[13]。因此，抑制氧化損傷構成對抗癌癥發(fā)生防御系統(tǒng)的一道防線，其被認為是阻止癌癥最有效的方式，大量的細胞和臨床前期試驗表明優(yōu)秀的抗氧化劑可預防癌癥[14-16]。因此，RSV可能通過卓越的抗氧化作用保護維護正常細胞的基因組穩(wěn)定性，本研究發(fā)現(xiàn)，NCM460細胞中，RSV處理可以顯著降低GIN，并增加細胞NDI；另一方面，有研究發(fā)現(xiàn)，RSV能增強癌細胞中ROS的產(chǎn)生，并誘導細胞毒性[17]。本實驗中，RSV處理SW620細胞24h可以顯著抑制細胞增殖，降低細胞NDI，促進細胞凋亡。RSV已被證明能具有調(diào)節(jié)抗氧化系統(tǒng)sirtuin1(SIRT1)、超氧化物歧化酶(SOD)、核因子紅細胞2相關因子2(NRF2)、一氧化氮合酶(eNOS)等基因的效應[18-21]，其可能通過差異影響抗氧化系統(tǒng)相關基因的影響，在正常和癌細胞中展現(xiàn)出不同的效應，從而維護正常細胞基因組穩(wěn)定性，誘發(fā)癌細胞中基因組不穩(wěn)定性，繼而對正常和癌細胞的生長狀況也出現(xiàn)差異影響。

表觀遺傳機制在維護基因組穩(wěn)定性和調(diào)節(jié)基因表達中起到重要作用，其異常調(diào)節(jié)可能導致包括癌癥在內(nèi)的人類疾病。天然植物化學物質(zhì)可以通過影響負責染色質(zhì)重塑的機制和蛋白來調(diào)節(jié)哺乳動物表觀基因組。存在于水果、種子和蔬菜植物中的化學物質(zhì)可作為強效細胞抗氧化劑和抗癌劑，其中大多均具有表觀調(diào)節(jié)的生物活性[22-23]。研究發(fā)現(xiàn)RSV具有表觀調(diào)節(jié)活性，在DU145(突變型p53)和LNCaP(野生型p53)前列腺癌細胞系中，RSV下調(diào)轉移相關蛋白1(MTA1)，導致MTA1/NuRD的穩(wěn)定性降低，從而促進p53乙?；罨痆24]。另一項研究顯示RSV可通過影響乳腺癌全基因組甲基化，繼而調(diào)節(jié)19個癌基因和8個抑癌基因的表達狀態(tài)[25]。大量研究證實，正常和癌細胞中常表現(xiàn)不同的表觀調(diào)節(jié)模式，這可能是多酚類物質(zhì)在正常和癌細胞中出現(xiàn)差異效應的另一重要基礎。

本研究發(fā)現(xiàn)，RSV可降低正常細胞的GIN，同時誘發(fā)結腸癌細胞高水平的GIN，可能是其在多種疾病中表現(xiàn)出有益效應的分子基礎。但本結果僅限于在體外培養(yǎng)的結腸細胞中，在活體中以及其他細胞類型是否會得到統(tǒng)一的結果還有待進一步探討。