麻痹性貝類毒素體外生物毒性檢測(cè)方法的建立

于志強(qiáng)，孫 運(yùn)，陳小青，劉漢偉，馬中春*

(寧波中盛產(chǎn)品檢測(cè)有限公司/寧波海關(guān)技術(shù)中心，浙江 寧波 315000)

貝類毒素是由海洋中的有毒藻類通過食物鏈傳遞給藻食性的貝類，并在其體內(nèi)蓄積、放大、轉(zhuǎn)化形成的有毒高分子化合物[1]。進(jìn)食含有貝類毒素的貝類海洋食品可能造成食物中毒。在所有的貝類產(chǎn)品食物中毒事件中，麻痹性貝類毒素(paralyticshellfish poisoning，PSP)中毒占87%，被公認(rèn)為是對(duì)健康危害最嚴(yán)重的之一[2]。我國(guó)海洋赤潮毒素中最常見的主要也是麻痹性貝類毒素[3]。因此，對(duì)海洋性貝類食品的檢測(cè)中麻痹性貝類毒素基本上為必檢項(xiàng)目。目前對(duì)于麻痹性貝類毒素的檢測(cè)方法主要為小鼠生物法、高效液相色譜法和酶聯(lián)免疫測(cè)定法[4]。其中小鼠生物法為大多數(shù)檢測(cè)機(jī)構(gòu)的常用方法。而小鼠生物法不滿足“3R”原則(replacement，reductionandrefinement)的要求，因此尋找一種更加簡(jiǎn)便、靈敏、高效、準(zhǔn)確的麻痹性貝類毒素檢測(cè)方法已經(jīng)成為我國(guó)各個(gè)檢測(cè)機(jī)構(gòu)的研究重點(diǎn)。

石房蛤毒素(saxitoxin，STX)是麻痹性貝類毒素主要成員之一[5]，具有麻痹性貝類毒素的典型結(jié)構(gòu)與特征，是《GB5009.213-2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)：貝類中麻痹性貝類毒素的測(cè)定》中明確規(guī)定的陽性標(biāo)準(zhǔn)品，現(xiàn)階段對(duì)麻痹性貝類毒素的檢測(cè)方法均是應(yīng)用石房蛤毒素作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品建立的，因此，本研究也采用STX為陽性標(biāo)準(zhǔn)品建立新的體外細(xì)胞檢測(cè)方法。

神經(jīng)干細(xì)胞(neuralstemcell，NSC)是一類具有自我更新和多向分化潛能的特殊細(xì)胞，利用它不僅可以探討神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的分子機(jī)制，也可作為一種替代手段用于中樞神經(jīng)損傷、退行性疾病和神經(jīng)性腫瘤等的治療和研究[6]。本研究應(yīng)用小鼠神經(jīng)干細(xì)胞建立麻痹性貝類毒素體外生物毒性檢測(cè)方法，利用其自我更新和分化潛能的特性，其更加接近生物體內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞對(duì)麻痹性貝類毒素的反應(yīng)，檢測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確、靈敏、高效，并且符合“3R”原則，為貝類毒素的檢測(cè)提供了研究的新思路、新方向。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 毒素和細(xì)胞 石房蛤毒素(CRM-STX-f)，購(gòu)于加拿大自然研究委員會(huì)；小鼠神經(jīng)干細(xì)胞，購(gòu)于上海素爾生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑和儀器 DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清均購(gòu)于Gibco公司；B27、L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉均購(gòu)于ThermoFisherScientific公司；堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basicfibroblastgrowthfactor，b-FGF)和表皮生長(zhǎng)因子(epidermalgrowthfactor，EGF)均購(gòu)于PeproTech公司；胰蛋白酶購(gòu)于HyClone公司；Cell CountingKit-8(CCK-8)細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海同仁化學(xué)研究所；烏本苷、藜蘆堿均購(gòu)自Sigma公司；96孔板購(gòu)自Costar公司。

CO2培養(yǎng)箱購(gòu)于德國(guó)Binder公司；倒置顯微鏡購(gòu)于日本Olympus公司；超凈工作臺(tái)購(gòu)于Biox公司；超速離心機(jī)購(gòu)于德國(guó)Hermle公司；多功能酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó)MolecularDevices(MD)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 NSC細(xì)胞培養(yǎng) 將凍存的NSC于37℃的水浴中迅速融化，在超凈臺(tái)中轉(zhuǎn)移至裝有已預(yù)熱完全培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)12 h后，將NSC轉(zhuǎn)移至離心管中，800r/min離心3 min，棄上清，更換新的完全培養(yǎng)基繼續(xù)于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d。于培養(yǎng)的第4天進(jìn)行傳代：將NSC球轉(zhuǎn)移至離心管中，800r/min離心3min，棄上清；用1 mL0.05%的胰酶37℃消化5min(中間輕輕搖動(dòng)幾次，以保證消化效果更充分)；加入1mL培養(yǎng)基(或PBS)終止消化，輕輕吹打，將細(xì)胞球打散，1000r/min離心3min，棄上清重懸后進(jìn)行傳代。

1.2.2 細(xì)胞毒性檢測(cè) NSC接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的毒性檢測(cè)。每孔分別加入170μL培養(yǎng)液和10μL標(biāo)準(zhǔn)品(劑量分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4ng)，各劑量設(shè)5個(gè)重復(fù)孔，每孔再加10mmol/L的烏本苷10μL及1mmol/L的藜蘆堿10μL。同時(shí)設(shè)置5個(gè)烏本苷及藜蘆堿對(duì)照孔，以培養(yǎng)液替代STX陽性劑。另設(shè)5孔為只加30 μL的培養(yǎng)基的空白對(duì)照孔。將培養(yǎng)板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。每孔加20 μLCCK-8溶液(注意不要產(chǎn)生氣泡)，輕搖混勻，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2h。用酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)定各孔D(450)值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)算出各組數(shù)據(jù)的平均數(shù)和方差，在Excel中輸入數(shù)據(jù)，以D(450)值為縱坐標(biāo)，STX含量為橫坐標(biāo)建立直角坐標(biāo)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過散點(diǎn)相關(guān)性分析得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，并得到直線相關(guān)系數(shù)R2以判斷線性關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 顯微鏡觀察NSC生長(zhǎng)情況

顯微鏡下觀察正常NSC生長(zhǎng)情況，結(jié)果見圖1。NSC培養(yǎng)第1天，為單細(xì)胞懸液；于培養(yǎng)第2～3天，NSC聚集成為小神經(jīng)球；培養(yǎng)第4天，由于NSC克隆增殖，小神經(jīng)球逐漸增大為大神經(jīng)球。

2.2 加入STX后各組NSC生長(zhǎng)情況

空白對(duì)照組NSC生長(zhǎng)活躍，形態(tài)為正常圓球狀；烏本苷及藜蘆堿對(duì)照組可見較多細(xì)胞出現(xiàn)腫脹破裂，STX組可見腫脹或破裂死亡的細(xì)胞，但細(xì)胞形態(tài)多為正常(見圖 2)。

2.3 STX各劑量組D(450)值測(cè)定

通過酶標(biāo)儀測(cè)定的空白對(duì)照組、烏本苷及藜蘆堿對(duì)照組以及各STX劑量組平均D(450)值及標(biāo)準(zhǔn)差見表1。

圖1 顯微鏡下觀察神經(jīng)干細(xì)胞生長(zhǎng)情況

圖2 顯微鏡下觀察加入STX后各組神經(jīng)干細(xì)胞生長(zhǎng)情況

表1 各組D(450)值測(cè)量結(jié)果

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

STX的含量在0.2～1.0ng范圍內(nèi)與D(450)值呈劑量反應(yīng)關(guān)系，而在1.0～1.4ng范圍內(nèi)不具有劑量反應(yīng)關(guān)系，其在0.2～1.0ng范圍內(nèi)得可得到直線回歸方程：y=1.252+0.495x(r=0.9980，P＜0.01)。根據(jù)此結(jié)果制作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖3。

3 討論

圖3 STX細(xì)胞毒性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線

現(xiàn)階段，對(duì)于麻痹性貝類毒素的檢測(cè)方法主要為小鼠生物法、高效液相色譜法和ELISA檢測(cè)法，這3種方法都是國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB5009.213-2016中明確提到的檢測(cè)方法，并且已被廣大檢測(cè)機(jī)構(gòu)所采用，同時(shí)小鼠生物法更是由于其檢測(cè)結(jié)果更接近人體對(duì)毒素的反應(yīng)以及不需要特殊儀器設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，而成為了檢測(cè)麻痹性貝類毒素的首選方法[7]。但是該方法也暴露出了很多問題，如小鼠之間存在個(gè)體差異，對(duì)毒素的敏感性不盡相同，因此，造成了檢測(cè)靈敏度不高，結(jié)果偏差較大[8]。高效液相色譜法由于麻痹性毒素的標(biāo)準(zhǔn)品較少、儀器設(shè)備昂貴、需要專業(yè)的技術(shù)人員等問題限制了其廣泛的應(yīng)用于各個(gè)檢測(cè)機(jī)構(gòu)[9-10]。于兵[11]、羅輝武等[12]一致認(rèn)為ELISA是快速篩選麻痹性貝類毒素的首選技術(shù)，但ELISA檢測(cè)法需要應(yīng)用麻痹性貝類毒素的相關(guān)抗體，由于難以獲得大量抗體，造成麻痹性貝類毒素的ELISA檢測(cè)試劑盒價(jià)格居高不下，使其檢測(cè)成本過高，推廣難度較大。綜上，目前急需一種新型檢測(cè)方法滿足檢測(cè)需要。體外細(xì)胞檢測(cè)方法由此應(yīng)運(yùn)而生，其具有上述3種方法中不可替代的優(yōu)點(diǎn)：減少動(dòng)物的使用，檢測(cè)成本低，操作簡(jiǎn)便。因此，此方法可成為一種新型麻痹性貝類毒素的檢測(cè)手段。

本研究應(yīng)用STX等麻痹性貝類毒素能夠抑制烏本苷和藜蘆堿引起的Na+內(nèi)流造成的細(xì)胞腫脹破裂，減少細(xì)胞死亡的原理，建立檢測(cè)麻痹性貝類毒素方法。應(yīng)用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，對(duì)細(xì)胞的需求量不大，應(yīng)用小鼠神經(jīng)干細(xì)胞，由于其具有自我更新和多向分化的特性，其生理特點(diǎn)更接近于原代細(xì)胞，其檢測(cè)結(jié)果較致瘤化的細(xì)胞系更能體現(xiàn)動(dòng)物體內(nèi)細(xì)胞對(duì)毒素的真實(shí)反映。同時(shí)本方法操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的陽性劑只需納克級(jí)，對(duì)待檢樣品的需求量較小。并且在一定范圍內(nèi)測(cè)量的吸光度值與STX的含量具有正相關(guān)關(guān)系，以此初步建立了麻痹性貝類毒的細(xì)胞檢測(cè)方法。

本研究建立的檢測(cè)方法對(duì)細(xì)胞狀態(tài)要求較高，細(xì)胞生長(zhǎng)活躍可以提高檢測(cè)的靈敏度，其后續(xù)研究將進(jìn)一步優(yōu)化條件并應(yīng)用建立的細(xì)胞檢測(cè)方法對(duì)待檢樣品進(jìn)行檢測(cè)。