白介素17與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)標(biāo)志物在左右半結(jié)腸癌中的表達(dá)及其意義

李欣欣，廖偉南，莊少惠，陳煥杰，陳君填，章斐然，李 威

(1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院胃腸外科，廣東 汕頭 515041；2.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院麻醉科，廣東 汕頭 515041)

結(jié)腸癌(coloncancer)是中國乃至全球最常見的的消化道惡性腫瘤，基于2018年全球癌癥數(shù)據(jù)庫GLOBOCAN統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，結(jié)腸癌發(fā)病率居全球第4位，患者約109萬人，位居消化系統(tǒng)腫瘤第1位，死亡人數(shù)55萬人，在消化系統(tǒng)腫瘤中居第2位[1]。因此，結(jié)腸癌的病因、影響因素、預(yù)防和診治日益成為醫(yī)學(xué)研究的重要內(nèi)容之一。而近年來隨著對結(jié)腸癌研究的深入，其中左右半結(jié)腸在流行病學(xué)、組織病理、局部微環(huán)境、分子特性、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等許多方面具有明顯的差異，目前更趨向于將結(jié)腸癌分為左右半結(jié)腸癌兩個獨(dú)立個體進(jìn)行研究。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelialmesenchymaltransition，EMT)及白細(xì)胞介素17(interleukin-17，IL-17)已被證明參與了多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移，目前關(guān)于結(jié)腸癌IL-17和EMT的研究多提示為促進(jìn)作用，但仍有其他研究提示IL-17可抑制腫瘤的發(fā)展，同時二者之間的關(guān)系及其二者在左半結(jié)腸及右半結(jié)腸是否具有差異性尚未見到明確報道。本研究擬通過檢測結(jié)腸癌中IL-17和EMT相關(guān)標(biāo)志物E-鈣黏蛋白(E-cadherin，E-cad)、波形蛋白(vimentin，Vim)mRNA的表達(dá)，探討其對結(jié)腸癌的作用及其與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系，同時探討IL-17、E-cad、VimmRNA表達(dá)在左、右半結(jié)腸癌中是否存在差異。

1 材料與方法

1.1 病例資料

選取2018-01-01—2018-12-31汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院胃腸外科收治的43例結(jié)腸癌患者(其中左半結(jié)腸癌27例，右半結(jié)腸癌16例)的臨床樣本和病例資料，包括癌組織及其距腫瘤邊緣≥5cm的癌旁正常組織，所有病例均排除炎癥性腸病、風(fēng)濕性及其他免疫系統(tǒng)相關(guān)疾病。結(jié)腸癌患者的年齡范圍為38～86歲，中位年齡為64歲；根據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會(AmericanJointCommitteeofCancer，AJCC)第七版結(jié)腸癌TNM標(biāo)準(zhǔn)：I期6例，II期22例，III期10例，IV期5例。臨床樣本的收集和使用均已經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會審核并批準(zhǔn)，取得所有患者簽字同意。

1.2 主要試劑

RNA提取試劑盒購自北京全式金技術(shù)有限公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑及實時熒光定量 PCR(quantitativerealtimePCR，qPCR)試劑購自日本Takara寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司。qPCR中采用的IL-17及E-cad、Vim基因引物及內(nèi)參β-actin基因引物均由華大基因合成。超微量分光光度計NanoDrop2000購自美國ThermoFisher Scientific公司，實時熒光定量PCR儀購自美國Bio-rad公司。

1.3 標(biāo)本取材與保存

手術(shù)標(biāo)本離體后，記錄腫瘤大小及形態(tài)后于腫瘤處及距腫瘤邊緣≥5cm的癌旁正常組織處切取約20 mg組織各2塊，裝入經(jīng)高溫高壓的無RNA酶EP管，迅速置入裝有液氮的小型液氮瓶中快速冰凍，運(yùn)輸至實驗室后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱進(jìn)行長期保存。手術(shù)標(biāo)本離體半小時內(nèi)完成標(biāo)本取材及冷凍工作。

1.4 RNA提取

將收集的結(jié)腸癌及其配對癌旁正常組織各20mg在液氮冷凍下經(jīng)研缽研磨成粉末狀，使用全式金RNA提取試劑盒抽提組織組織中總RNA，用NanoDrop 2000超微量分光光度計計算RNA濃度。

1.5 qPCR法檢測IL-17及EMT標(biāo)志物mRNA表達(dá)水平

按照Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作提示，去除基因組DNA并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增以用于qPCR過程。按照Takara實時熒光定量PCR檢測試劑盒說明書提供的方法進(jìn)行兩步法PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序，采 用 2-ΔΔCT×1000法計算E-cad、Vim及IL-17的mRNA相對表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行結(jié)果數(shù)據(jù)分析。癌與癌旁組織配對樣本的計量資料以中位數(shù)(四分位間距)表示并用配對非參數(shù)檢驗分析。左右半結(jié)腸癌組織的mRNA相對表達(dá)及臨床資料分析中采用中位數(shù)(四分位間距)表示，并采用非參數(shù)檢驗進(jìn)行分析。IL-17與EMT與結(jié)腸癌之間的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)性分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-17和EMT標(biāo)志物E-cad、VimmRNA表達(dá)水平

采用qPCR檢測IL-17和EMT標(biāo)志物E-cad、Vim mRNA在結(jié)腸癌及癌旁正常組織中的表達(dá)水平，結(jié)果見表1和圖1。可見與癌旁正常組織相比，腫瘤組織中E-cadmRNA的表達(dá)量明顯下調(diào)，Vim和IL-17 mRNA的表達(dá)量明顯升高，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05或0.01)。

2.2 IL-17、E-cad、VimmRNA在左、右半結(jié)腸癌中的表達(dá)差異

結(jié)果見表2，IL-17mRNA在左半結(jié)腸中的表達(dá)較右半結(jié)腸升高，具有統(tǒng)計學(xué)差異，而E-cad及Vim在左半結(jié)腸及右半結(jié)腸中的相對表達(dá)量的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

表1 qPCR檢測IL-17及E-cad、VimmRNA的表達(dá)

圖1 結(jié)腸癌和正常組織中IL-17和EMT標(biāo)志物 mRNA表達(dá)趨勢

表2 IL-17及E-cad、Vim在左右半結(jié)腸癌中的mRNA表達(dá)

表3 結(jié)腸癌組織中IL-17、E-cad及VimmRNA的表達(dá)水平與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

2.3 IL-17與EMT相關(guān)標(biāo)志物mRNA表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性

IL-17與EMT標(biāo)志物E-cad之間R=0.036(P=0.818)，與Vim之間R=0.042(P=0.790)，其相關(guān)性均不具有統(tǒng)計學(xué)意義。E-cadmRNA的表達(dá)在60歲以上患者較60歲以下升高，且具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.039)。余IL-17及E-cad、VimmRNA在不同年齡段、性別、TNM分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者間的差異均不具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

已有文獻(xiàn)證實，至少1/4的腫瘤與慢性感染(例如肝炎)或慢性炎癥所致(如前列腺炎)有關(guān)[2]。此外，無明顯前驅(qū)炎癥的腫瘤中，也存在大量的炎癥細(xì)胞和介質(zhì)[2-3]。IL-17是一種常見的炎癥因子，在多種腫瘤中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用，包括在乳腺癌、肺癌、胃癌及前列腺癌等均起促進(jìn)作用[4-7]，但也有其他研究表明IL-17可抑制腫瘤生長[8-9]。同時，炎癥也與EMT緊密相關(guān)，其可通過內(nèi)源性及外源性兩條通路進(jìn)行調(diào)整，增強(qiáng)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的能力[10-13]。在既往的研究中，結(jié)腸癌往往被作為一個整體進(jìn)行研究。然而隨著對結(jié)腸癌的胚胎起源、生物學(xué)行為、基因等層面的研究不斷深入，現(xiàn)在更傾向于將左半和右半結(jié)腸當(dāng)做獨(dú)立個體進(jìn)行研究。

通過本實驗我們發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌中IL-17mRNA的表達(dá)水平較正常組織升高，考慮其作為炎癥因子，可能在結(jié)腸癌中起促進(jìn)作用。而EMT相關(guān)標(biāo)志物的mRNA表達(dá)情況則提示結(jié)腸癌組織中存在EMT進(jìn)程。綜合相關(guān)研究，在此結(jié)果基礎(chǔ)上我們推測IL-17對腫瘤的影響是否可能通過在腫瘤微環(huán)境中產(chǎn)生炎癥反應(yīng)而啟動EMT進(jìn)程，促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展。但將IL-17和EMT相關(guān)標(biāo)志物進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示未見相關(guān)，因此提示IL-17雖然可能促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但其機(jī)制可能并非通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。綜合其他文獻(xiàn)可知，IL-17可能通過局部炎癥導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的生存增殖，形成一個有利于腫瘤細(xì)胞生長的免疫抑制微環(huán)境，并通過一系列的血管生成因子促進(jìn)腫瘤血管的生成，促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[14]。但是，Jiang[15]在胃癌研究中發(fā)現(xiàn)了IL-17可通過促進(jìn)胃癌細(xì)胞EMT從而增加腫瘤的侵襲性，與本研究結(jié)果并不一致。而Xie[16]在小鼠肝細(xì)胞癌模型的研究中則發(fā)現(xiàn)，IL-17可以通過直接抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞，降低血管生成因子IL-6、IL-8和VEGF的表達(dá)，抑制腫瘤血管生成從而延緩腫瘤進(jìn)程。因此，IL-17在不同腫瘤中的作用差異或可作為今后研究的重點。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)IL-17在結(jié)腸癌中表達(dá)升高，其可能作為炎癥因子，在局部形成炎癥反應(yīng)，參與并促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但其與結(jié)腸癌EMT相關(guān)標(biāo)志物之間并無明顯相關(guān)。同時，雖然左右半結(jié)腸的胚胎來源、生物學(xué)行為等存在差異，但EMT在二者之間并無差異，而IL-17在左半結(jié)腸癌中表達(dá)明顯高于右半結(jié)腸癌，分析其原因，可能是左半結(jié)腸癌多呈浸潤型，且腸腔較細(xì)，易致急慢性腸梗阻，更容易導(dǎo)致炎癥從而引起IL-17mRNA表達(dá)水平升高。展望未來，IL-17做為常見炎癥因子，有望成為監(jiān)測與預(yù)警結(jié)腸癌侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后差的重要指標(biāo)和治療靶點之一，具有重要的臨床意義。