鄰苯二甲酸二(2-乙基己)酯對(duì)小鼠睪丸損傷及p-CREB蛋白表達(dá)的影響

薄存香，張 玉，白 金，韓 茹，陳尚雅，賽林霖*

(山東省職業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病防治研究院，山東第一醫(yī)科大學(xué)/山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，山東 濟(jì)南 250014)

鄰苯二甲酸二(2-乙基己)酯[di-(2-ethylhexyl)phthalate，DEHP]屬于鄰苯二甲酸酯類(phthalate esters，PAEs)化合物，是常用的塑化劑，因DEHP與塑料間是氫鍵或范德華力結(jié)合，易于擴(kuò)散至周圍環(huán)境造成污染[1]。DEHP是一種典型的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(environmentalendocrinedisruptors，EEDs)[2]，具有擬雌激素或抗雄激素作用[3-4]，可引起雄性動(dòng)物生殖內(nèi)分泌激素紊亂、睪丸萎縮、生精障礙等[5]，環(huán)磷酸腺苷(cyclicadenosinemonophosphate，cAMP)反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP-responseelementbindingprotein，CREB)信號(hào)通路是與精子發(fā)生密切相關(guān)的途徑之一[6]。本研究采用青春期雄性小鼠染毒DEHP，觀察其對(duì)睪丸的損傷及對(duì)睪丸組織中p-CREB蛋白表達(dá)的影響，探討DEHP的睪丸毒性及其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

DEHP(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，純度≥99.0%，溶劑為玉米油。p-CREB抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司，羊抗鼠IgG及DAB購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；HM325輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(Thermo)，YT-7FB攤烤片機(jī)、2T-12M組織脫水機(jī)、YT-6LF石蠟包埋機(jī)均購(gòu)自湖北亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司。OLYSIABioreport圖像拍攝系統(tǒng)，購(gòu)于日本奧林巴斯公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及處理

選擇初斷乳雄性ICR小鼠40只，體質(zhì)量16～18 g，由濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司提供，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(魯)20140007。按體質(zhì)量隨機(jī)分為對(duì)照組(等體積玉米油)和DEHP染毒組(250、500、1000 mg/kg)，每組10只。經(jīng)口灌胃，1次/天，6次/周，連續(xù)灌胃染毒8周，于末次染毒24h后處死。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.3.1 一般狀況觀察 每天觀察小鼠進(jìn)食、飲水、行為活動(dòng)、尿液、糞便等有無(wú)異常，每周稱量小鼠體質(zhì)量一次。

1.3.2 睪丸、附睪臟器系數(shù) 分別處死各組小鼠后，迅速分離收集雙側(cè)睪丸和附睪，并按下式計(jì)算睪丸和附睪臟器系數(shù)。

1.3.3 精子計(jì)數(shù) 取各組小鼠雙側(cè)附睪尾稱取質(zhì)量后，在4mL37℃生理鹽水中剪碎，4層擦鏡紙過(guò)濾，制成精子懸液，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)精子數(shù)。

1.3.4 睪丸組織病理學(xué)檢查 各組隨機(jī)選取3只小鼠的睪丸，以4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)病理切片，光鏡下觀察睪丸組織形態(tài)學(xué)變化。

1.3.5 免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)睪丸組織中p-CREB蛋白的表達(dá) 主要操作步驟如下：睪丸組織石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，3%H2O2室溫封閉5～10min，置于0.01%枸櫞酸鹽緩沖液中微波抗原修復(fù)10min，5%～10%免疫血清封閉30min，加一抗(均為1∶100稀釋)置于37℃、1h后4℃過(guò)夜，HRP標(biāo)記二抗(37℃、45min)，加SP(37℃、45min)，DAB顯色，上述各步之間均以0.01mol/LPBS洗3次，每次5min，最后胞核復(fù)染、脫水、透明、封片。用0.01mol/LPBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

免疫組化結(jié)果判斷[7]：陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞被染成棕黃色，陰性表達(dá)的細(xì)胞不顯色。結(jié)果判定按染色細(xì)胞的數(shù)量比和染色深度進(jìn)行半定量測(cè)定。顯微鏡下(400倍)對(duì)每例標(biāo)本均隨機(jī)觀察5個(gè)曲細(xì)精管，結(jié)果根據(jù)染色程度及染色細(xì)胞百分率進(jìn)行評(píng)定，不著色為0分，基本不著色為1分，著色淡為2分，著色深為3分。無(wú)著色細(xì)胞為0分，著色細(xì)胞占計(jì)數(shù)細(xì)胞＜1/3為1分，≥1/3～2/3為2分，≥2/3為3分。判定結(jié)果：兩者相加除以2，0分為陰性(-)，＜1為弱陽(yáng)性(+)，≥1～2為中等陽(yáng)性(++)，≥2～3分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 DEHP染毒對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響

DEHP染毒后，500、1000mg/kg劑量組各有1只小鼠于給藥后第6周出現(xiàn)會(huì)陰部污穢，于4～6d后恢復(fù)正常，其他小鼠未見明顯異常癥狀；給藥后第1周1000mg/kg劑量組小鼠體質(zhì)量低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 DEHP染毒對(duì)小鼠睪丸、附睪臟器系數(shù)及精子計(jì)數(shù)的影響

隨著染毒劑量增加，睪丸和附睪質(zhì)量下降，3個(gè)染毒組附睪系數(shù)和1000mg/kg組睪丸系數(shù)均顯著低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。各染毒組精子計(jì)數(shù)均較對(duì)照組明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 DEHP染毒對(duì)小鼠睪丸、附睪臟器系數(shù)及精子計(jì)數(shù)的影響(n=10，)

表1 DEHP染毒對(duì)小鼠睪丸、附睪臟器系數(shù)及精子計(jì)數(shù)的影響(n=10，)

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2.3 DEHP染毒小鼠睪丸組織形態(tài)學(xué)改變

對(duì)照組睪丸生精上皮排列整齊，形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，管腔中無(wú)脫落細(xì)胞，可見大量精子生成，支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量和結(jié)構(gòu)均正常；250mg/kg組光鏡下發(fā)現(xiàn)局部生精上皮排列疏松、紊亂、層次減少。500、1000mg/kg組曲細(xì)精管上皮細(xì)胞排列疏松、紊亂、層次減少，管腔內(nèi)有成團(tuán)脫落的上皮細(xì)胞(見圖1)。

圖1 各組小鼠睪丸組織病理檢查結(jié)果(×200)

2.4 睪丸組織中p-CREB蛋白的表達(dá)

免疫組化染色結(jié)果顯示，小鼠睪丸組織中p-CREB蛋白主要在圓形和長(zhǎng)形精子細(xì)胞中表達(dá)，陽(yáng)性產(chǎn)物主要位于胞核，精原細(xì)胞和精母細(xì)胞呈陰性表達(dá)，而在Sertoli細(xì)胞、管周細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞包括Leydig細(xì)胞中呈散在弱陽(yáng)性表達(dá)(見圖2)。

圖2 DEHP染毒小鼠睪丸組織中p-CREB蛋白的表達(dá)(×400)

隨著DEHP染毒劑量增加，小鼠睪丸組織中p-CREB蛋白表達(dá)減弱，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少，p-CREB蛋白表達(dá)評(píng)分降低，DEHP500和1000mg/kg組較對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，見表2)。

表2 DEHP對(duì)睪丸組織中p-CREB蛋白表達(dá)的影響

3 討論

DEHP是目前全球使用最為廣泛的鄰苯二甲酸酯類塑料增塑劑之一。釋放到環(huán)境中的DEHP可經(jīng)消化道、呼吸道等途徑進(jìn)入機(jī)體，其毒性作用主要表現(xiàn)在生殖毒性、胚胎發(fā)育毒性、免疫毒性、遺傳毒性、神經(jīng)毒性等方面。研究表明，DEHP對(duì)雄性生殖系統(tǒng)的損害主要表現(xiàn)為睪丸毒性[8]。曲莉等[9]分別以250、500和1000mg/kgDEHP灌胃染毒成年雄性小鼠，每天1次，連續(xù)4周后發(fā)現(xiàn)，隨著DEHP劑量的升高，雄性小鼠睪丸與附睪質(zhì)量及其臟器系數(shù)、精子計(jì)數(shù)呈下降趨勢(shì)，精子畸形率呈上升趨勢(shì)。在相同的DEHP暴露劑量下，幼齡動(dòng)物的敏感性更強(qiáng)，本研究選擇初斷乳的雄性小鼠進(jìn)行了8周的DEHP染毒，結(jié)果顯示，DEHP各染毒組附睪系數(shù)及精子計(jì)數(shù)均低于對(duì)照組，1000mg/kg組睪丸臟器系數(shù)低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；各染毒組小鼠睪丸生精上皮出現(xiàn)排列紊亂、層數(shù)減少、脫落等不同程度損傷。

細(xì)胞凋亡是發(fā)生在多細(xì)胞生物體中的一個(gè)調(diào)節(jié)過(guò)程。Sun等[10]研究發(fā)現(xiàn)DEHP可通過(guò)上調(diào)睪丸組織中Caspase-3、Caspase-8、Bax的蛋白水平，降低睪丸組織Bcl-2表達(dá)誘導(dǎo)睪丸組織凋亡。本研究各染毒組睪丸組織出現(xiàn)生精上皮細(xì)胞脫落可能與DEHP引起生精細(xì)胞凋亡有關(guān)。

cAMP/CREB信號(hào)通路參與精子的發(fā)生、運(yùn)動(dòng)、獲能等過(guò)程。cAMP與PKA的調(diào)節(jié)亞基結(jié)合導(dǎo)致催化亞基的釋放，并轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核，使CREB在Ser133發(fā)生磷酸化。磷酸化的CREB結(jié)合到靶基因的特定序列cAMP反應(yīng)元件，從而調(diào)節(jié)下游靶基因(睪丸組織所特有或參與精子發(fā)生的基因)的轉(zhuǎn)錄[6]，CREB的磷酸化是該通路的關(guān)鍵。Sheng等[11]研究發(fā)現(xiàn)CREB的磷酸化可導(dǎo)致小鼠精原細(xì)胞和人精原細(xì)胞瘤細(xì)胞大量增殖。有研究[12]報(bào)道CREB基因缺失、蛋白表達(dá)下調(diào)或蛋白磷酸化異常，均可導(dǎo)致生精細(xì)胞凋亡和壞死增加、精子生成減少，和減數(shù)分裂特有基因的表達(dá)下調(diào)。小鼠生精上皮發(fā)育根據(jù)形態(tài)學(xué)特征分為12個(gè)階段[13]，自生精上皮基底部至腔面，依次有精原細(xì)胞、初級(jí)精母細(xì)胞、次級(jí)精母細(xì)胞、精子細(xì)胞和精子。本研究結(jié)果顯示DEHP染毒后小鼠睪丸p-CREB主要在精子細(xì)胞表達(dá)，提示該信號(hào)通路在減數(shù)分裂后精子發(fā)生過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用。p-CREB蛋白表達(dá)水平與精子數(shù)量和精子存活率呈正相關(guān)[14]，本研究DEHP各染毒組小鼠精子數(shù)量減少，DEHP500和1000 mg/kg組小鼠睪丸組織中p-CREB蛋白出現(xiàn)下調(diào)，提示DEHP染毒組小鼠生精數(shù)量減少可能與DEHP抑制CREB蛋白激酶磷酸化有關(guān)。

DEHP能導(dǎo)致腎臟損傷[15]，本研究DEHP500和1000mg/kg組小鼠出現(xiàn)會(huì)陰部污穢是否DEHP也可損傷泌尿系統(tǒng)或由其他部位引起還需進(jìn)一步研究。DEHP致睪丸組織p-CREB表達(dá)下調(diào)的機(jī)制尚不明確，是否與DEHP引起cAMP含量減少[16]，或CREB磷酸化激酶如cAMP依賴蛋白激酶A、Ca2+/鈣調(diào)素依賴蛋白激酶Ⅳ等活性下降等有關(guān)[17]，尚需進(jìn)一步研究。