徽州地區(qū)菊花的指紋圖譜鑒別及其評(píng)價(jià)研究

徐蘇麗，邢麗花，任 霞，史素影，劉玉梅，高廣印，呂 勝，俞年軍

(1. 黃山職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)系，安徽 黃山 245000；2. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；3. 安徽廣印堂中藥股份有限公司，安徽 亳州 236800；4. 安徽省旌德縣人民醫(yī)院，安徽 旌德 242600)

1 材料

1.1 藥材 徽州地區(qū)菊花樣品采自安徽省歙縣、休寧縣、旌德縣、績(jī)溪縣，見(jiàn)表1，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)俞年軍教授鑒定為菊科植物菊(ChrysanthemummorifoliuRamat.)的干燥頭狀花序，其中包括貢菊、七月菊、金絲皇菊、黃菊。

1.2 儀器 Agilent 1260 Infinity Ⅱ 液相色譜儀(包括G7111A四元泵、G7129A自動(dòng)進(jìn)樣器、G7114A紫外檢測(cè)器)：美國(guó)Agilent公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市晶玻實(shí)驗(yàn)儀器廠；AS系列超聲清洗機(jī)：天津奧特賽恩斯儀器有限公司；竑力HL-200A型高速多功能打粉機(jī)：上海賽耐機(jī)械有限公司。

1.3 試劑 綠原酸(批號(hào) 11075-200413，純度≥98%)、木犀草苷(批號(hào) 111720-201609，純度>94.9%)、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸(批號(hào) 111782-201706，純度>97.3%)：中國(guó)食品藥品檢定研究院。乙腈(色譜純)：瑞典Oceanpak；純化水：自制；磷酸(色譜純)：天津永大化學(xué)試劑有限公司；其余所用試劑均為分析純。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件 Topsil HPLC C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為0.1%磷酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～11 min，10%～12% B；11～13 min，12%～14% B；13～45 min，14%～18% B；45～46 min，18%～21% B；46～55 min，21%～24% B；55～80 min，24%～26% B；80～85 min，26%～45% B；85～90 min，45%～55% B；90～105 min，55%～10% B)，柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)325 nm，進(jìn)樣量10 μL。

2.2 樣品制備

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 分別精密稱取綠原酸1.26 mg、木犀草苷1.23 mg、3,5-O-二咖啡?；鼘幩?.43 mg，置于50 mL容量瓶中，用75%甲醇定容，配制成25.2 μg/mL綠原酸、24.6 μg/mL木犀草苷、108.6 μg/mL 3,5-O-二咖啡?；鼘幩峄旌蠈?duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 稱取菊花樣品粉末(過(guò)2號(hào)篩)1.0 g，置于100 mL圓底燒瓶中，加入75%甲醇30 mL，水浴回流提取1.5 h，平行3次。合并濾液，濃縮，定容于50 mL容量瓶?jī)?nèi)，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取樣品S1，供試品溶液按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，并記錄液相色譜圖，結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD≤1.39%，共有峰相對(duì)峰面積的RSD≤2.43%，表明儀器精密度良好。

兩者舵的使用情況見(jiàn)圖6和圖7，可很直觀地看出，使用指數(shù)函數(shù)修飾的控制器進(jìn)行航向控制時(shí)，動(dòng)舵幅度較模糊控制小很多，通過(guò)使用MATLAB進(jìn)行計(jì)算可以得到，圖6的平均舵角為1.94°，圖7的平均舵角為2.27°，平均舵角下降了0.33°，降幅約為15%,而舵的使用情況在一定程度上可反映出船舶能量的消耗，以及船舶營(yíng)運(yùn)過(guò)程中船員的舒適感。所以,使用指數(shù)函數(shù)修飾的航向保持控制器，不僅能夠降低能源的消耗，而且還在一定程度上改善船員的工作生活環(huán)境。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取S1樣品粉末6份，制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD≤3.99%，共有峰相對(duì)峰面積的RSD≤4.77%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取S1樣品粉末制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，分別在0、4、8、12、24、36 h進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD≤4.25%，共有峰相對(duì)峰面積RSD≤3.98%，表明供試品溶液在36 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 徽州地區(qū)菊花樣品指紋圖譜的建立 取徽州地區(qū)20批菊花粉末(過(guò)2號(hào)篩)，精密稱定，供試品溶液按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，記錄液相色譜圖。

2.4.1 共有峰的確定及指認(rèn) 將20批徽州地區(qū)菊花樣品色譜圖AIA文件導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004版)，進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，設(shè)置S1為參照指紋圖譜，多點(diǎn)校正匹配，篩選出12個(gè)共有峰，通過(guò)對(duì)照品比對(duì)可知，2號(hào)峰為綠原酸，4號(hào)峰為木犀草苷，7號(hào)峰為3,5-O-二咖啡?；鼘幩?。對(duì)照品圖譜與樣品圖譜見(jiàn)圖1，20批菊花樣品指紋圖譜重疊圖見(jiàn)圖2。

2.4.2 相似度分析 對(duì)實(shí)驗(yàn)得到的20批徽州地區(qū)菊花樣品色譜圖進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)分析，結(jié)果表明20批徽州地區(qū)菊花樣品相似度均在0.701～0.997之間，不同品種的菊花相似度存在差異，其中S12、S17為金絲皇菊，與貢菊的相似度較低，均小于0.75。而同一品種不同產(chǎn)地的菊花相似度較高，S3、S13為貢菊，與貢菊之間的相似度較好，均大于0.98。見(jiàn)表2。

注：2.綠原酸；4.木犀草苷；7. 3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸；其他峰對(duì)應(yīng)的化學(xué)物質(zhì)尚未被確定

圖1混合對(duì)照品(A)、樣品(B)的高效液相色譜圖

注：2.綠原酸；4.木犀草苷；7. 3,5-O-二咖啡?；鼘幩?；其他峰對(duì)應(yīng)的化學(xué)物質(zhì)尚未被確定

S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10S11S12S13S14S15S16S17S18S19S20S11S20.9921S30.9970.9911S40.9930.9850.9991S50.7820.7740.7690.7601S60.8400.8040.8420.8490.8981S70.7660.7360.7660.7720.9280.9821S80.8950.8690.9070.9170.8410.9750.9401S90.8690.8520.8680.8670.9630.9580.9520.9341S100.7990.7970.7890.7810.9970.8910.9170.8460.9651S110.8130.7930.8060.8020.9780.9520.9590.8990.9860.9731S120.7030.7020.6780.6610.9770.8100.8520.7250.9000.9700.9351S130.9990.9930.9960.9920.7970.8480.7770.8990.8810.8140.8280.7221S140.8850.8580.8930.9020.8630.9870.9580.9970.9450.8650.9180.7570.8901S150.9980.9860.9960.9920.7790.8420.7630.8930.8710.7970.8150.7010.9970.8821S160.8050.7840.7970.7920.9750.9420.9460.8830.9820.9700.9980.9380.8200.9030.8091S170.7340.7270.7180.7080.9960.8760.9170.8040.9430.9900.9690.9870.7510.8320.7310.9671S180.9870.9930.9870.9810.8040.8170.7540.8730.8760.8290.8190.7350.9900.8630.9840.8140.7581S190.9990.9880.9980.9950.7790.8440.7670.8990.8730.7970.8150.6980.9980.8880.9990.8090.7300.9871S200.9850.9940.9800.9710.8070.8060.7450.8580.8660.8300.8160.7500.9880.8510.9800.8100.7650.9920.9821

2.4.3 聚類分析 將20批徽州地區(qū)菊花樣品的12個(gè)共有峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 23.0軟件，采用質(zhì)心聚類，歐氏距離平方法為度量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)菊花樣品的高效液相色譜指紋圖譜進(jìn)行聚類分析，結(jié)果可知，將菊花樣品分為兩大類，S9(黃菊)聚為一大類，其他分為一大類，其中將S6、S7、S8、S14(七月菊)聚為一小類，S5、S12、S17(金絲皇菊)聚為一小類，將S1、S16(黃菊)聚為一小類，除S10外，其他樣品(貢菊)分為一類。因此，聚類分析除S9、S10外，將貢菊、金絲皇菊、七月菊、黃菊分別聚為一類。其中貢菊與七月菊的親緣關(guān)系距離較近，金絲皇菊與黃菊親緣關(guān)系距離較近。具體見(jiàn)圖3。

2.4.4 主成分分析 為全面評(píng)價(jià)20批徽州地區(qū)菊花樣品質(zhì)量，對(duì)12個(gè)共有峰進(jìn)行主成分分析。運(yùn)用共有峰面積數(shù)據(jù)分析軟件，得出各共有峰方差貢獻(xiàn)表，見(jiàn)表3。12個(gè)共有峰中得出3種主成分，第一主成分貢獻(xiàn)率為38.61%，第二主成分貢獻(xiàn)率為27.51%，第三主成分貢獻(xiàn)率為16.28%，3種主成分累積貢獻(xiàn)率達(dá)82.40%，即該3種主成分能夠反映徽州地區(qū)菊花的基本信息。

圖3 20批菊花樣品的聚類分析樹(shù)狀圖

為進(jìn)一步確定徽州地區(qū)菊花藥材的主成分，將20批菊花樣品共有峰面積導(dǎo)入SIMCA-P(11.0)中，用PCA on X-block模型對(duì)樣品進(jìn)行主成分分析[12]。主成分得分見(jiàn)圖4。由圖可知20批菊花樣品的主成分為4、8、11號(hào)峰，其中4號(hào)峰為木犀草苷，8、11號(hào)峰未知，需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。通過(guò)主成分分析PCA得分圖(圖5)可知，以4、8、11號(hào)峰3個(gè)主成分為指標(biāo)成分進(jìn)行得分分析，其中S1、S2、S3、S4、S13、S15、S18、S19、S20為一得分區(qū)，S6、S7、S8、S14(藍(lán)色點(diǎn))為一得分區(qū)，S5、S10、S11、S16、S17(紅色點(diǎn))為一得分區(qū)，其分類結(jié)果與聚類分析一致。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同流動(dòng)相、檢測(cè)波長(zhǎng)、洗脫比例、柱溫等因素進(jìn)行考察，結(jié)果確定乙腈-0.1%磷酸水為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為325 nm，柱溫為30 ℃，在該方法下色譜圖分離度及峰形較好，響應(yīng)值較好，此方法重復(fù)性、穩(wěn)定性等均滿足實(shí)驗(yàn)要求。采用相似度評(píng)價(jià)軟件對(duì)20批徽州地區(qū)菊花樣品指紋圖譜進(jìn)行分析，確定了12個(gè)共有峰，經(jīng)對(duì)照品比對(duì)指認(rèn)2號(hào)峰為綠原酸，4號(hào)峰為木犀草苷，7號(hào)峰為3,5-O-二咖啡?；鼘幩帷Ｑ芯拷Y(jié)果發(fā)現(xiàn)各批次樣品之間相似度較大，其中不同產(chǎn)地貢菊樣品間相似度較高，均大于0.98。這說(shuō)明徽州其他地區(qū)的種植貢菊與傳統(tǒng)核心產(chǎn)區(qū)歙縣貢菊具有相同內(nèi)在質(zhì)量，因此，貢菊道地產(chǎn)區(qū)除歙縣外，應(yīng)該包括績(jī)溪、休寧、旌德等相鄰地區(qū)。這為滿足市場(chǎng)需求，擴(kuò)大種植面積，促進(jìn)貢菊的產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供了依據(jù)。

表3 20批菊花樣品共有峰的總方差解釋

圖4 共有峰得分圖

圖5 20批菊花樣品主成分分析得分圖

聚類分析結(jié)果表明，除S9、S10外，將貢菊、金絲皇菊、七月菊、黃菊分別聚為一類。這說(shuō)明徽州地區(qū)種植的不同品種菊花之間內(nèi)在質(zhì)量存在一定的差異，與黃菊、金絲皇菊相比，七月菊與貢菊的距離較近，七月菊是貢菊的人工栽培品[13]。因此，為保證道地藥材貢菊的質(zhì)量，種植應(yīng)以原有貢菊品種為主體。

本實(shí)驗(yàn)建立的高效液相色譜指紋圖譜方法能簡(jiǎn)單、快速地對(duì)徽州地區(qū)貢菊與其他菊花品種進(jìn)行區(qū)分，為菊花的資源開(kāi)發(fā)提供依據(jù)，也為徽州地區(qū)菊花的質(zhì)量控制與品質(zhì)評(píng)價(jià)提供初步的研究基礎(chǔ)。