復(fù)發(fā)性流產(chǎn)腎虛證小鼠子宮蛻膜組織miRNA表達(dá)譜檢測(cè)及生物信息學(xué)分析

王瑞雪，董小鵬，儲(chǔ)繼軍

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230031)

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(repeated spontaneous abortion，RSA)是指3次或3次以上妊娠28周之前的胚胎或胎兒丟失。中醫(yī)學(xué)稱(chēng)之為“數(shù)墮胎”或“滑胎”。RSA是一種常見(jiàn)妊娠并發(fā)疾病，據(jù)估計(jì)，人類(lèi)妊娠中自然流產(chǎn)的發(fā)生率為50%～60%，RSA在育齡婦女中發(fā)病率為1%～5%[1]。RSA已經(jīng)成為嚴(yán)重影響婦女生殖健康與安全的疾病，流產(chǎn)次數(shù)越多其復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)越高。引起RSA的原因較多，可能包括先天遺傳、女性解剖異常、內(nèi)分泌紊亂、盆腔感染因素、男性因素、心理因素及免疫因素等，但其確切機(jī)制尚未明了。細(xì)胞的功能起始于基因的表達(dá)，轉(zhuǎn)錄組概念上是指在某一時(shí)間階段個(gè)體細(xì)胞內(nèi)所有基因轉(zhuǎn)錄形成的RNA的總稱(chēng)[2]。對(duì)轉(zhuǎn)錄組的分析可以獲得高通量基因表達(dá)的RNA相關(guān)信息，從而揭示基因表達(dá)與某種生命現(xiàn)象之間的關(guān)系[3]。中醫(yī)的“證”，是對(duì)疾病過(guò)程中機(jī)體整體動(dòng)態(tài)的階段性病理特征之概括，是人體整體病理狀態(tài)的實(shí)時(shí)反映，而這種狀態(tài)又是復(fù)雜多變的[4-5]。研究認(rèn)為微小RNA(microRNA，miRNA)表達(dá)具有時(shí)序性、特異性，這種表達(dá)特點(diǎn)與中醫(yī)證候的上述特性相吻合，miRNA表達(dá)異常引起的相應(yīng)基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控紊亂常常是導(dǎo)致疾病發(fā)生的重要內(nèi)在原因[6]。因此，從miRNA調(diào)控角度研究正常妊娠和RSA腎虛證miRNA表達(dá)之間的相關(guān)性，探索RSA腎虛證和正常妊娠小鼠子宮蛻膜組織的miRNA差異表達(dá)譜，可能為該病的中醫(yī)辨證分型更加規(guī)范和客觀化提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 采用SPF級(jí)CBA/J小鼠，6～7周齡，體質(zhì)量(25±5)g，共25只；SPF級(jí)DBA/2小鼠，6～7周齡，體質(zhì)量(25±5)g，共10只；SPF級(jí)BALB/c小鼠，6～7周齡，體質(zhì)量(25±5)g，共3只。以上小鼠均由重慶恩斯維爾生物科技有限公司[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(渝)2017-0003]提供，在SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)1周。

1.2 主要試劑和儀器 高速臺(tái)式離心機(jī)(BACKMAN CS-15R)：美國(guó)Beckman公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀：加拿大Funglyn Biotech；電泳儀：美國(guó)Bio-rad；凝膠成像儀穩(wěn)壓DNA電泳儀：美國(guó)Tianneng；GDS8000凝膠掃描系統(tǒng)：美國(guó)UVP；高速臺(tái)式離心機(jī)(BACKMAN CS-15R)：美國(guó)Beckman公司；水合氯醛：上海Aladdin；羥基脲：齊魯制藥有限公司；補(bǔ)腎安胎沖劑：安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑。

2 方法

2.1 模型復(fù)制 采用具有隱性、反復(fù)性和父系特異性特征的DBA/2小鼠×CBA /J小鼠的Clark經(jīng)典RSA小鼠模型[7]。RSA模型復(fù)制方法：將雌性CBA/J小鼠與雄性DBA/2按2∶1的比例于擬交配日18:00合籠，次日早上8:30檢查陰道栓。正常妊娠模型復(fù)制方法：將雌性CBA/J小鼠與BALB/c小鼠按2∶1的比例于擬交配日18:00合籠，次日早上8:30檢查陰道栓，肉眼觀察陰道口有無(wú)乳白色、固態(tài)膠狀物，發(fā)現(xiàn)明顯陰栓者為陽(yáng)性。檢出陰栓的CBA/J小鼠計(jì)為妊娠第0天，進(jìn)入下一步實(shí)驗(yàn)。模型復(fù)制成功后小鼠分為兩組：正常對(duì)照組(正常妊娠小鼠)：予10 μL/g NaCl灌胃；模型組(RSA腎虛證小鼠)：妊娠第1～7天每日給予羥基脲450 mg/kg灌胃(藥物濃度為45 mg/mL，灌胃劑量10 mL/kg)+10 mL/kg NaCl灌胃；每組小鼠5只，共10只。注意觀察各組CBA/J小鼠一般狀態(tài)，每4 d稱(chēng)量體質(zhì)量，測(cè)量飲水和飼料1次并記錄。各組CBA/J小鼠腹腔注射麻醉并解剖后觀察子宮形態(tài)、顏色、宮口、宮腔內(nèi)變化并記錄數(shù)據(jù)，剖視子宮觀察胚胎丟失情況并計(jì)算流產(chǎn)率；分離出各組子宮蛻膜組織，冰PBS緩沖液洗凈，-80 ℃保存用于后續(xù)檢測(cè)。

2.2 小鼠子宮蛻膜組織提取及RNA芯片處理 對(duì)正常妊娠小鼠(樣本編號(hào)A)及RSA腎虛證小鼠子宮蛻膜組織(樣本編號(hào)B)RNA的提取及純化步驟按AMBION抽提試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，樣品檢測(cè)結(jié)果均為A級(jí)合格，可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.3 RNA標(biāo)記與芯片雜交 取100 ng總RNA，定容至2 μL。①配制去磷酸化混合液(CIP Master Mix)。PCR反應(yīng)：37 ℃，30 min；樣品變性：在每管樣品中添加2.8 μL 100% DMSO混勻離心，將上述反應(yīng)混合液置于100 ℃ PCR儀中5～10 min，再迅速轉(zhuǎn)入冰水浴中冷卻；連接標(biāo)記：將10×T4 RNA Ligase Buffer置于37 ℃溫育并間隔渦旋，直至沉淀全部溶解，然后將其冷卻至室溫備用。②配制連接反應(yīng)混合液(Ligation Master Mix)。PCR反應(yīng)：16 ℃溫育2 h；標(biāo)記后RNA純化，純化后樣品抽干，準(zhǔn)備10×阻滯劑(Blocking Agent)。③配置反應(yīng)體系(Hybridization Mix)。反應(yīng)條件設(shè)置：100 ℃，5 min ；冰水5 min；上芯片，55 ℃ 20 h，20 r/min滾動(dòng)雜交。④芯片洗滌：取出芯片洗滌，洗脫后利用Agilent Scanner G2505C(Agilent Technologies)掃描得到原始圖像。

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR)驗(yàn)證篩選出的miRNA 采用相對(duì)定量法對(duì)結(jié)果進(jìn)行比較分析，以U6 RNA作為內(nèi)參。首先進(jìn)行RNA的提取，按照qRT-PCR的操作步驟，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件設(shè)置：25 ℃ 10 min，42 ℃ 50 min，85 ℃ 5 min；熒光定量PCR擴(kuò)增條件設(shè)置：94 ℃ 4 min；94 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共循環(huán)35次，72 ℃檢測(cè)信號(hào)。每個(gè)標(biāo)本均采用3個(gè)復(fù)孔。

2.5 生物信息學(xué)分析方法 采用Feature Extraction 軟件 (Version 10.7.1.1，Agilent Technologies)處理原始圖像，提取原始數(shù)據(jù)。然后利用Genespring軟件(Version 13.1，Agilent Technologies)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化過(guò)濾數(shù)據(jù)和后續(xù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。將至少有一組100%標(biāo)記為“Detected”的探針篩選保留做下一步分析，對(duì)于無(wú)生物學(xué)重復(fù)者僅利用差異倍數(shù)值進(jìn)行篩選，標(biāo)準(zhǔn)是差異倍數(shù)值≥2.0。然后應(yīng)用3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)(Targetscan，microRNAorg，pita)共同對(duì)差異miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，接著對(duì)所預(yù)測(cè)的靶基因進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析和基因本體(Gene Ontology，GO)分析，以判定差異miRNA所影響的細(xì)胞分子通路或者生物學(xué)功能。qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行兩個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，若P<0.05則視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 RSA腎虛證小鼠子宮蛻膜組織表達(dá)上調(diào)倍數(shù)≥2的miRNA 與正常對(duì)照組比較，模型組子宮蛻膜組織表達(dá)上調(diào)倍數(shù)≥2的miRNA共有22條。見(jiàn)表1。

表1 RSA腎虛證小鼠子宮蛻膜組織表達(dá)上調(diào)倍數(shù)≥2的miRNA

3.2 RSA腎虛證小鼠子宮蛻膜中表達(dá)下調(diào)倍數(shù)≥2的miRNA 與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠蛻膜中表達(dá)下調(diào)倍數(shù)≥2的miRNA共41個(gè)。見(jiàn)表2。

3.3 靶基因預(yù)測(cè) 從檢測(cè)出的差異表達(dá)的miRNA中選取變化較為明顯的14個(gè)miRNA(mmu-miR-7235-5p、mmu-miR-146a-5p、mmu-miR-155-5p、mmu-miR-185-5p、mmu-miR-192-5p、mmu-miR-202-3p、mmu-miR-328-3p、mmu-miR-34b-5p、mmu-miR-34c-5p、mmu-miR-483-5p、mmu-miR-676-3p、mmu-miR-700-3p、mmu-miR-872-5、mmu-miR-92b-3p)，通過(guò)3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)(Targetscan，microRNAorg，pita)，共同對(duì)差異miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，結(jié)合既往自然流產(chǎn)基因檢測(cè)研究中證實(shí)的相關(guān)基因，共篩選出3 401個(gè)預(yù)測(cè)靶基因；分別選取其中上調(diào)的3個(gè)miRNA、下調(diào)的3個(gè)miRNA，列出其預(yù)測(cè)的部分靶基因。見(jiàn)表3。

3.4 qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果 根據(jù)miRNA表達(dá)譜芯片檢測(cè)的結(jié)果，選取miR-92b-3p用實(shí)時(shí)熒光定量PCR再次驗(yàn)證，逆轉(zhuǎn)錄引物：GCGCGTGAGCAGGCTGGAGAAATTAACCACGCGCGGAGGC，結(jié)果顯示其變化趨勢(shì)與芯片法的結(jié)果是吻合的，表明miRNA芯片檢測(cè)結(jié)果真實(shí)有效；熔解曲線顯示單峰者表明產(chǎn)物特異性良好。見(jiàn)表4。

3.5 GO分析 應(yīng)用GO數(shù)據(jù)庫(kù)，針對(duì)靶基因作進(jìn)一步功能富集分析，獲得差異miRNA 靶基因總數(shù)，對(duì)應(yīng)的靶基因的顯著性基因功能的篩選以P<0.01為標(biāo)準(zhǔn)，富集積分(enrichment score)=-log10(P值)[8]。這些靶基因主要富集在轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA模板化、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的陽(yáng)性調(diào)控、多細(xì)胞生物發(fā)育、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的負(fù)調(diào)控以及蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)等多個(gè)生物過(guò)程方面。

3.6 KEGG通路富集分析 對(duì)這些靶基因進(jìn)行調(diào)控通路分析，計(jì)算的結(jié)果會(huì)返回一個(gè)富集顯著性的P值，越小的P值表明靶基因在該通路中富集表達(dá)。以P<0.01為標(biāo)準(zhǔn)，Enrichment Score=-log10(P值)。排列在前20個(gè)顯著富集的KEGG通路表明，這些miRNA的異常表達(dá)可能與癌癥通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、細(xì)胞吞噬、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)控、黏著斑、軸突導(dǎo)向信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、PAP-1信號(hào)通路等的激活有關(guān)。

4 討論

RSA是一種常見(jiàn)的妊娠并發(fā)疾病，其確切發(fā)病機(jī)制尚不十分明確。miRNAs是一組內(nèi)源性的非編碼性RNA，是一類(lèi)新發(fā)現(xiàn)的生物基因表達(dá)調(diào)控因子，其長(zhǎng)度為19～24個(gè)核苷酸[9]。人類(lèi)基因組中總共有1 048條miRNA，這些miRNA可以調(diào)控超過(guò)30%的基因，從而參與調(diào)控機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育等許多復(fù)雜的生命過(guò)程。也就是說(shuō)，一個(gè)mRNA可以接受多個(gè)miRNA調(diào)控，單個(gè)miRNA也可以調(diào)控多個(gè)mRNA[10]。這種現(xiàn)象表明miRNA分子是基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的核心組成部分。最近的研究更進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)miRNA失調(diào)與人類(lèi)癌癥發(fā)生之間有密切的聯(lián)系[11]。而胚胎攜帶父系遺傳物質(zhì)，相對(duì)于母體屬于“外來(lái)的”半同種移植物卻可被母體容受，胚胎著床于子宮的過(guò)程類(lèi)似于腫瘤對(duì)機(jī)體的侵襲過(guò)程。有研究證明，在胚胎發(fā)育過(guò)程中miRNA具體重要作用[12]。如譚彬等[13]檢測(cè)了自然流產(chǎn)模型小鼠與正常妊娠小鼠子宮蛻膜組織差異表達(dá)的miRNAs，利用miRNAs芯片數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)小鼠流產(chǎn)蛻膜組織和正常蛻膜組織之間有13個(gè)miRNAs存在明顯表達(dá)差異，預(yù)測(cè)軟件顯示miR-21和miR-26a的靶基因分別是和妊娠相關(guān)的金屬蛋白酶抑制因子RECK和白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)兩個(gè)因子，因此認(rèn)為小鼠子宮蛻膜組織miR-21和miR-26a的差異性表達(dá)可能在小鼠胚胎自然流產(chǎn)過(guò)程中具體關(guān)鍵作用。李怡等[14]研究認(rèn)為，miR-10b可能促進(jìn)了滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)功能，參與了早期自然流產(chǎn)的病理過(guò)程。WANG等[15]發(fā)現(xiàn)miR-133a在自然流產(chǎn)中具體重要作用，推測(cè)miR-133a可能是通過(guò)抑制HLA-G的翻譯過(guò)程而參與了自然流產(chǎn)這一事件的發(fā)生。HU Y等[16]研究報(bào)道，pri-miR-125a的A-T單體型突變降低了miR-125a表達(dá)量，從而減弱了對(duì)靶基因LIF受體和ERBB2的有效抑制，可能與習(xí)慣性流產(chǎn)患者易患性有關(guān)。余秋波等[17]利用U133 plus 2.0芯片對(duì)自然流產(chǎn)絨毛和正常絨毛組織中絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞EVTs的基因表達(dá)譜進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)與正常EVTs相比，在自然流產(chǎn)EVTs中，發(fā)現(xiàn)顯著上調(diào)基因219個(gè)，下調(diào)基因293個(gè)，認(rèn)為與滋養(yǎng)層細(xì)胞粘附、免疫應(yīng)答、水解酶及凋亡等相關(guān)基因的差異表達(dá)可能與滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲行為變化及自流產(chǎn)有關(guān)。miRNA及其調(diào)節(jié)的特性與中醫(yī)治病求本機(jī)制有著密切的關(guān)聯(lián)性[18]。

中醫(yī)辨證論治因其確切穩(wěn)定的療效，被廣泛應(yīng)用于滑胎的治療。腎藏精，主生殖，為“先天之本”，腎氣腎精充足旺盛對(duì)女性生殖能力至關(guān)重要，是胞胎能夠在子宮正常著床發(fā)育的前提。張錫純《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》云：“男女生育，皆賴(lài)腎氣作強(qiáng)，腎旺自能蔭胎也?！惫省澳I可系胎”，腎氣腎精虧虛常常引起自然流產(chǎn)甚至RSA。中醫(yī)公認(rèn)腎虛證是滑胎的主要證型，現(xiàn)代著名中醫(yī)婦科醫(yī)家羅頌平亦認(rèn)為腎虛不能固攝、腎氣虧虛是導(dǎo)致滑胎的主要病因，氣血、沖任二脈的耗損是其主要病機(jī)。

表2 RSA腎虛證小鼠子宮蛻膜組織表達(dá)下調(diào)倍數(shù)≥2的miRNA

表3 RSA腎虛證小鼠差異表達(dá)倍數(shù)≥2的miRNA及其預(yù)測(cè)靶基因

表4 正常妊娠小鼠與RSA腎虛證小鼠蛻膜miR-92b-3p表達(dá)水平比較

注：ΔCt=目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct；相對(duì)表達(dá)量=2(-ΔCt)；相對(duì)比值=目的基因相對(duì)拷貝數(shù)/內(nèi)參基因相對(duì)拷貝數(shù)；與正常對(duì)照組比較，*P<0.05

本研究通過(guò)差異基因篩選尋找出63條表達(dá)顯著的差異基因，由于本研究中異常調(diào)節(jié)的miRNA所調(diào)控的靶基因較多，通過(guò)對(duì)miRNA所調(diào)控的靶基因進(jìn)行GO分析，構(gòu)建RSA蛻膜組織差異miRNA與靶基因功能調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，得出處于網(wǎng)絡(luò)核心調(diào)控位置的miRNA所調(diào)控的靶基因進(jìn)行GO分析，構(gòu)建RSA蛻膜組織差異miRNA與靶基因功能調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，得出處于網(wǎng)絡(luò)核心調(diào)控位置的miRNA、被調(diào)控的核心靶基因以及多個(gè)關(guān)鍵性基因功能。上述差異基因表達(dá)產(chǎn)物通過(guò)各種方式影響了轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA模板化、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的陽(yáng)性調(diào)控、多細(xì)胞生物發(fā)育、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的負(fù)調(diào)控、蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生物學(xué)過(guò)程，其中又涉及多種信號(hào)通路的改變，如癌癥通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、細(xì)胞吞噬、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)控、黏著斑、軸突導(dǎo)向信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、PAP-1信號(hào)通路等。這一結(jié)果證實(shí)了RSA腎虛證的形成可能是由其基因表達(dá)異常，進(jìn)一步引起機(jī)體多種細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)的復(fù)雜化多樣化過(guò)程。

本研究從基因水平展開(kāi)研究，結(jié)果初步顯示兩個(gè)證型間存在著差異表達(dá)基因譜，這也說(shuō)明中醫(yī)臨床證型的分類(lèi)具有特定的生理指標(biāo)和特定的差異表達(dá)基因的依據(jù)[2]。因本研究的樣本量仍不夠大，其結(jié)果還有待下一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證，從而為闡明中醫(yī)“證”本質(zhì)提供更加客觀的生物學(xué)標(biāo)志物，亦有利于深入了解中藥在RSA治療中的分子和基因調(diào)控機(jī)制。