糖尿病大鼠四肢痛閾及周圍神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)的變化

周 芳,劉 康,潘 俠,黃亞醫(yī),王 龍

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院麻醉科,武漢 430060;*通訊作者,E-mail:wanglongwhu@163.com)

糖尿病是一組代謝臨床綜合征,其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。目前糖尿病的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型主要分為遺傳性動(dòng)物模型、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型和誘發(fā)性動(dòng)物模型。前兩者由于價(jià)格昂貴、飼養(yǎng)困難,發(fā)病程度難以把握及經(jīng)驗(yàn)有限等缺點(diǎn)采納較少,而誘發(fā)性動(dòng)物模型研究得比較清楚,是大多數(shù)學(xué)者常采用的模型。誘發(fā)性動(dòng)物模型最常采取的辦法是使用手術(shù)或者化學(xué)方法破壞動(dòng)物的胰腺組織,其中最常使用的化學(xué)藥物有STZ和四氧嘧啶。STZ不僅能直接破壞胰島β細(xì)胞,還能通過誘導(dǎo)一氧化氮(NO)和自由基的合成,激活自身免疫過程,從而導(dǎo)致β細(xì)胞的損壞。而四氧嘧啶主要是通過產(chǎn)生超氧自由基破壞β細(xì)胞,導(dǎo)致胰島素合成減少,胰島素缺乏。相比較而言,STZ單次腹腔注射制備糖尿病模型動(dòng)物死亡率低,成模率高,模型穩(wěn)定,操作方便,價(jià)格低廉,是目前國(guó)內(nèi)外普遍使用的造模方法。然而此方法大鼠出現(xiàn)痛閾改變的時(shí)間報(bào)道不一,分析原因可能與動(dòng)物品種、STZ配置方法、STZ用量、痛閾測(cè)定方法等相關(guān)。本文結(jié)合武漢大學(xué)人民醫(yī)院用藥經(jīng)驗(yàn)及其他學(xué)者經(jīng)驗(yàn)[1-3],采用60 mg/kg體質(zhì)量STZ單次腹腔注射建立糖尿病大鼠模型,旨在觀察大鼠四肢痛閾的改變以及背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和腓腸神經(jīng)的病理改變。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6周齡雄性SD大鼠50只,清潔級(jí),體質(zhì)量200-220 g,來(lái)源于中國(guó)湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[SCXK(湘)2016-0002],飼養(yǎng)于武漢大學(xué)人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(SPF級(jí))[SYXK(鄂)2015-0027],每籠3-4只大鼠,自由攝食飲水,動(dòng)物室內(nèi)有良好的通風(fēng)和空氣過濾系統(tǒng),室內(nèi)溫度在20-22 ℃,濕度50%-67%,光照與黑暗時(shí)間各為12 h,每天更換墊料,每周更換籠具3次。每只動(dòng)物在飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)過程中均按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷[WDRM(福)第20150702]。

1.2 主要儀器與試劑

美國(guó)強(qiáng)生穩(wěn)豪倍優(yōu)血糖儀;Von Frey纖維絲(美國(guó)Stoelting公司);STZ(美國(guó)Sigma公司);枸櫞酸緩沖液粉劑(北京華科盛公司)。

1.3 動(dòng)物分組

10只大鼠做為正常對(duì)照組,模型組40只。所有大鼠均適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,測(cè)定基礎(chǔ)血糖、體質(zhì)量、痛閾。將模型組的40只大鼠用于制備DM模型,DM造模不成功的大鼠予以剔除。

1.4 STZ溶液的配置

2% STZ溶液的配置:①稱取21.01 g的枸櫞酸粉劑,用雙蒸水溶解并將液體定容到1 000 ml,配置0.1 mol/L的枸櫞酸緩沖液;②稱取29.41 g的枸櫞酸鈉粉劑,雙蒸水溶解并定容至1 000 ml,配置0.1 mol/L的枸櫞酸鈉緩沖液;③取0.1 mol/L的枸櫞酸緩沖液22 ml,加入0.1 mol/L的枸櫞酸鈉緩沖液28 ml,混勻,配置pH4.5的枸櫞酸/枸櫞酸鈉緩沖液,4 ℃保存?zhèn)溆?④快速稱取STZ后置入干燥滅菌瓶?jī)?nèi),外用錫箔紙避光,將pH4.5的枸櫞酸/枸櫞酸鈉緩沖液及裝STZ的容器置冰浴帶入動(dòng)物室,在冰上操作配置2%的STZ溶液,現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.5 糖尿病模型的制備

糖尿病組采用高糖高脂飲食適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,于造模前禁食12 h,按60 mg/kg體質(zhì)量的劑量一次性腹腔注射2%的STZ溶液,腹腔注射72 h后經(jīng)尾靜脈取血測(cè)定空腹血糖,血糖≥16.7 mmol/L即為造模成功[1-3]。

1.6 機(jī)械痛閾的測(cè)定

采用up-and-down法,在糖尿病造模前、糖尿病造模成功后每周用Von Frey纖維絲(0.40,0.60,1.0,2.0,4.0,6.0,8.0,15.0 g)測(cè)定每組大鼠后腳趾對(duì)機(jī)械刺激50%縮爪閾值(mechanical withdrawal threshold,MWT)的改變。具體操作步驟如下:大鼠單獨(dú)置于有網(wǎng)眼的支架鐵絲板上,適應(yīng)環(huán)境約30 min;待大鼠安靜,用2.0 g力度的細(xì)絲由下向上垂直刺激兩側(cè)后趾外側(cè)皮膚,直至成S形,每次刺激持續(xù)時(shí)間為6-8 s。注意避開肉墊,大鼠在刺激時(shí)間內(nèi)或在移開von Frey纖維絲時(shí)立即出現(xiàn)快速的縮足反應(yīng)記為陽(yáng)性反應(yīng),除身體活動(dòng)引起的縮足反應(yīng),兩次刺激間隔時(shí)間最少為5 s;若無(wú)縮爪反應(yīng),則選擇更強(qiáng)力度的4.0 g刺激后腳趾;若有縮爪反應(yīng),則選擇較弱力度的1.0 g刺激后腳趾。依次類推,當(dāng)出現(xiàn)一次與前一次不同的反應(yīng)(如有縮爪反應(yīng)變?yōu)闊o(wú)縮爪反應(yīng),或無(wú)縮爪反應(yīng)變至有縮爪反應(yīng))時(shí),繼續(xù)依次刺激4次,包括先前的2次刺激,總共6次刺激,即可完成50%縮爪閾值的測(cè)定;若對(duì)有縮爪反應(yīng)時(shí)所需要的刺激力度高于15.0 g或低于0.40 g的時(shí),50%縮爪閾值則直接記為15.0 g或0.4 g[4-6]。

1.7 背根神經(jīng)節(jié)和腓腸神經(jīng)透射電鏡形態(tài)學(xué)觀察

造模成功后2,4,6周,每次隨機(jī)選取8只大鼠采用1%的戊巴比妥鈉(50 mg/kg,腹腔注射)麻醉,分離背根神經(jīng)節(jié)和腓腸神經(jīng),置于2%的戊二醛液中4 ℃保存。磷酸緩沖液漂洗3次,環(huán)氧樹脂包埋,常規(guī)超薄制片,醋酸雙鉛鈾和枸櫞酸鉛染色,用透射電鏡觀察。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 成模率及死亡率

40只大鼠,有33只血糖高于16.7 mmol/L達(dá)到成模標(biāo)準(zhǔn),造模成功率為82.5%;所有大鼠均存活,死亡率為0。

2.2 大鼠一般狀態(tài)的變化

正常組大鼠飲食及尿量正常,精神飽滿,反應(yīng)敏捷,體質(zhì)量隨周齡的增加而逐漸增加;糖尿病組大鼠造模后飲食、尿量明顯增多,隨病程的增加精神逐漸萎靡,反應(yīng)遲鈍,體型明顯消瘦(見圖1)。

與正常組相比,*P<0.05圖1 正常組與糖尿病組大鼠體質(zhì)量變化趨勢(shì)Figure 1 The variation trend of body weight in control group and diabetic group

2.3 血糖的變化

正常對(duì)照組血糖均在正常范圍,隨周齡無(wú)明顯變化;糖尿病組血糖在造模后第1周即明顯升高,此后隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加,且高血糖狀況持續(xù)整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程(見圖2),說明本實(shí)驗(yàn)糖尿病模型造模是成功的。

2.4 機(jī)械痛閾的改變

STZ造模成功后1周,糖尿病組大鼠的機(jī)械痛閾即低于正常組大鼠,且痛閾隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低,與正常組大鼠間存在顯著性差異(見圖3),說明隨糖尿病病程的進(jìn)展,大鼠逐漸出現(xiàn)痛覺敏化。

與正常組相比,*P<0.05圖2 正常組與糖尿病組大鼠血糖變化趨勢(shì)Figure 2 Changes of blood glucose in control group and diabetic group

與正常組相比,*P<0.05圖3 正常組與糖尿病組大鼠機(jī)械痛閾變化趨勢(shì)Figure 3 The variation trend of mechanical withdrawal threshold in control group and diabetic group

2.5 背根神經(jīng)節(jié)超微結(jié)構(gòu)的改變

糖尿病制模成功后第2周末,核膜無(wú)明顯皺褶,極少數(shù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)水腫,高爾基體清晰可見;第4周末可見核膜局部出現(xiàn)皺褶,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)水腫較明顯,小部分空泡化;第6周末核膜皺縮加重,絕大多數(shù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)空泡化(見圖4),說明隨糖尿病進(jìn)程的進(jìn)展,背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的損傷是逐漸加重的。

造模后2周末 造模后4周末 造模后6周末圖4 造模成功后電鏡下糖尿病組大鼠背根神經(jīng)節(jié)的變化 (×4 000)Figure 4 Changes of dorsal root ganglion cells after successful modeling under electron microscopy (×4 000)

2.6 腓腸神經(jīng)的超微結(jié)構(gòu)變化

糖尿病制模成功后第2周末,腓腸神經(jīng)結(jié)構(gòu)基本正常,髓鞘局部出現(xiàn)斷裂;第4周末髓鞘板層局部排列紊亂伴大量空泡形成;第6周末髓鞘正常形態(tài)消失,部分髓鞘已經(jīng)溶解吸收,軸突內(nèi)可見較多壞死物(見圖5),說明長(zhǎng)期的高血糖可導(dǎo)致有髓神經(jīng)纖維出現(xiàn)脫髓鞘改變,且這一改變也是隨糖尿病病程進(jìn)展而逐漸加重的。

造模后2周末 造模后4周末 造模后6周末圖5 造模成功后電鏡下糖尿病組大鼠腓腸神經(jīng)的變化 (×2 500)Figure 5 Changes of sural nerve after successful modeling under electron microscopy (×2 500)

3 討論

神經(jīng)病理性疼痛是常見的一種疼痛類型,據(jù)估計(jì)全世界有幾百萬(wàn)人遭受神經(jīng)病理性疼痛,約占總?cè)藬?shù)的7%[7]。糖尿病是引起神經(jīng)病理性疼痛的主要原因之一,嚴(yán)重影響病人的生活質(zhì)量,甚至造成功能障礙,還增加醫(yī)療費(fèi)用,加重家庭負(fù)擔(dān)。因此,該疼痛模型的建立對(duì)深入研究糖尿病的發(fā)病、治療、預(yù)防及其并發(fā)癥的轉(zhuǎn)歸有著重要意義。

糖尿病大鼠出現(xiàn)神經(jīng)病變的機(jī)制目前尚不清楚,但普遍認(rèn)為與高血糖是密切相關(guān)的[8]。已知SD大鼠的適應(yīng)性和抗病性比較強(qiáng),易于存活,故其常作為糖尿病動(dòng)物模型的優(yōu)先選擇。STZ是目前最常使用的糖尿病誘發(fā)性動(dòng)物模型方法[9],其溶液制劑不穩(wěn)定,研究顯示在配制STZ溶液時(shí),要求枸櫞酸緩沖液的pH值為4.0-4.5,且要現(xiàn)配現(xiàn)用,從配制好的溶液到給大鼠注射完畢最好不要超過1 h[10, 11]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)STZ造模的劑量的研究較多,小劑量為25-40 mg/kg,大劑量為50-65 mg/kg,STZ用量不同,可能與不同品系的大鼠及STZ在不同緩沖液中的穩(wěn)定性有關(guān)。本研究選擇60 mg/kg體質(zhì)量STZ單次腹腔注射,糖尿病造模成功率達(dá)82.5%,與文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)值接近[12]。

目前在動(dòng)物模型中多采用機(jī)械性觸誘發(fā)痛和熱誘發(fā)痛對(duì)大鼠的痛覺進(jìn)行測(cè)定。由于糖尿病神經(jīng)病理性疼痛初期,大鼠溫度痛閾改變不明顯,故輻射熱刺激檢測(cè)糖尿病痛覺過敏存在它的局限性,因此本研究對(duì)大鼠的機(jī)械痛閾進(jìn)行了動(dòng)態(tài)觀察。本研究顯示糖尿病造模成功后第1周末,即注射STZ后10 d,大鼠的機(jī)械痛閾已明顯下降,且下降幅度隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加,與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果基本相符[13]。

背根神經(jīng)節(jié)是初級(jí)傳入神經(jīng)元胞體所在部位,能夠傳導(dǎo)痛覺,已經(jīng)成為神經(jīng)病理性疼痛發(fā)病機(jī)制研究的重點(diǎn)。前人研究[14-16]顯示,光鏡下正常組大鼠神經(jīng)元形態(tài)未見明顯異常,呈多極狀,尼氏體清晰可見,呈斑塊狀或細(xì)粒狀散在均勻分布;而糖尿病組見部分神經(jīng)元變性壞死,胞體腫脹,胞質(zhì)著色淺,細(xì)胞由多極狀變?yōu)閳A形,尼氏體溶解消失。本研究顯示電鏡下糖尿病組的背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞出現(xiàn)明顯的病變,胞核、胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量的空泡化,線粒體極度水腫,部分細(xì)胞壞死,這與前人的組織病理學(xué)改變是一致的。

糖尿病患者并發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)病變大多數(shù)是以周圍神經(jīng)受累為主,其對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的損傷最早從有髓和無(wú)髓小神經(jīng)纖維開始,在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中多半選用腓腸神經(jīng)標(biāo)本作為病理觀察。有研究[17-20]顯示,光鏡下正常組神經(jīng)纖維排列緊密、分布均勻,單個(gè)纖維飽滿,細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,髓鞘著色均勻,可見半月形施旺細(xì)胞,而糖尿病組神經(jīng)纖維排列松散、模糊,扭曲、形態(tài)不規(guī)則,髓鞘變薄,部分?jǐn)嗔?密度不均勻,本研究顯示電鏡下糖尿病大鼠有髓神經(jīng)纖維普遍出現(xiàn)明顯的脫髓鞘,髓鞘板層排列紊亂、腫脹,低倍電鏡下可見部分髓鞘溶解消失,這與前人光鏡下所見的髓鞘變化是相吻合的。長(zhǎng)期的高血糖可以損害神經(jīng)的血管屏障,髓鞘糖基化改變其抗原性,促進(jìn)來(lái)自循環(huán)系統(tǒng)、組織及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的單核巨噬細(xì)胞發(fā)揮其吞噬功能,然后激活免疫細(xì)胞分泌細(xì)胞因子如IL-1β和TNF-α,導(dǎo)致糖尿病神經(jīng)病變的發(fā)生發(fā)展[21,22]。

本研究選用60 mg/kg體質(zhì)量的STZ單次腹腔注射成功制備了大鼠Ⅰ型糖尿病模型,動(dòng)態(tài)觀察了大鼠的一般狀態(tài)、血糖、痛閾及神經(jīng)的病理改變,結(jié)果顯示隨糖尿病病程增加,大鼠的血糖呈進(jìn)行性升高,痛閾逐漸降低,周圍神經(jīng)病變逐漸加重,為糖尿病神經(jīng)病理性疼痛早期干預(yù)治療的時(shí)間點(diǎn)選擇提供了參考依據(jù)。