ADAMTS1基因在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及其臨床意義

張麗慧,鄭建云,李子夏,梁 斌,秦泗佳,張耀超

(1陜西省西安醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)系口腔組織病理教研室,西安 710075;2陜西省西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科;*通訊作者,E-mail:zhanglihui222@163.com)

口腔癌是頭頸部較常見的惡性腫瘤,大約占惡性腫瘤的7%,每年呈遞增趨勢增加,已經(jīng)成為公共衛(wèi)生領(lǐng)域的重大問題?？谇话┲屑s90%為鱗狀細(xì)胞癌,而口腔鱗狀細(xì)胞癌的總體生存率卻在50%左右[1,2],所以對口腔鱗狀細(xì)胞癌的早期診斷就顯得尤為重要。含凝血酶敏感素基序的去整合素金屬蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs,ADAMTS)廣泛存在于哺乳動物和無脊椎動物中,屬于Zn2+依賴的金屬蛋白酶家族,該家族中已有19個成員被發(fā)現(xiàn),都是蛋白水解酶,并且蛋白水解功能可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移有關(guān)[3]。腫瘤的血管生成對于腫瘤的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移有重要意義,新生血管的形成被認(rèn)為是腫瘤進(jìn)展的1個標(biāo)志。抑制血管的生成就能抑制腫瘤的發(fā)展,而ADAMTS1的其中一個重要功能就是抑制血管新生[4]。本研究擬檢測ADAMTS1蛋白在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)情況,并結(jié)合病例資料,初步探討ADAMTS1在口腔鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用,為輔助臨床上口腔鱗狀細(xì)胞癌的早期診斷提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

收集西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院2016-06～2018-06間收治的48例口腔鱗狀細(xì)胞癌手術(shù)患者的標(biāo)本及相應(yīng)的癌旁正常組織標(biāo)本,所有標(biāo)本均經(jīng)過HE染色病理證實。其中男性34例,女性14例,年齡<50歲的16例,≥50歲32例;發(fā)生在舌部的22例,頰部的14例,其他部位12例;腫瘤直徑<4 cm的32例,≥4 cm的16例;高分化24例,中分化18例,低分化6例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移10例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 兔抗人ADAMTS1多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司);免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)開發(fā)公司);EDTA修復(fù)液(北京博奧森生物技術(shù)有限公司);DAB顯色液(北京中杉金橋生物技術(shù)開發(fā)公司)。

1.2.2 試驗方法 免疫組織化學(xué)S-P方法檢測口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中ADAMTS1蛋白表達(dá)

石蠟標(biāo)本常規(guī)連續(xù)切片,常規(guī)二甲苯脫蠟、水化后,3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶,EDTA緩沖液高壓熱抗原修復(fù)。加一抗(兔抗人ADAMTS1多克隆抗體1 ∶400稀釋),然后加生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG,4 ℃冰箱過夜后,加霉素康生物素蛋白-過氧化酶,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,行常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片。PBS代替一抗作陰性對照。采用已經(jīng)證實ADAMTS1表達(dá)陽性的人胎盤組織切片為陽性對照。

免疫組化染色根據(jù)半定量評分系統(tǒng)判定[5],通過染色密度和陽性染色細(xì)胞數(shù)來對ADAMTS1染色結(jié)果進(jìn)行綜合評分。①染色密度評分:0分,無染色;1分,弱染色;2分,中染色;3分,強(qiáng)染色;②陽性染色細(xì)胞百分比評分:0分,0%;l分,<33%;2分,33.67%;3分,>67%;總分=①×②?？偡帧?和<2被認(rèn)定為高表達(dá)(+)和低表達(dá)(-)。染色結(jié)果由兩個有經(jīng)驗的病理科醫(yī)師以雙盲法進(jìn)行診斷,一張切片至少選擇5個高倍鏡視野進(jìn)行觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料采用χ2檢驗進(jìn)行比較。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

ADAMTS1蛋白表達(dá)主要定位于細(xì)胞漿,少量位于細(xì)胞核,陽性表達(dá)呈黃色或棕黃色顆粒(見圖1),陰性表達(dá)為無或少表達(dá)(見圖2)。在口腔48例鱗狀細(xì)胞癌組織中,ADAMTS1的陽性表達(dá)率為45.8%(22/48),癌旁組織為83.3%(40/48),口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中ADAMTS1蛋白的陽性表達(dá)率顯著低于癌旁組織,兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);ADAMTS1表達(dá)與口腔鱗狀細(xì)胞癌患者的年齡、性別、發(fā)病部位、腫瘤大小、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分化程度等無關(guān)(P>0.05,見表1)。

圖1 ADAMTS1在口腔鱗狀細(xì)胞癌癌旁組織中的陽性表達(dá)Figure 1 Expression of ADAMTS1 in paracarcinoma tissues in oral squamous cell carcinoma (IHC,×400)

圖2 ADAMTS1在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中的陰性表達(dá)Figure 2 Negative expression of ADAMTS-1 in oral squamous cell carcinoma (IHC,×400)

3 討論

口腔鱗狀細(xì)胞癌是口腔癌中較為常見的惡性腫瘤,其總體生存率在50%左右,所以對口腔鱗狀細(xì)胞癌的早期診斷和治療就顯得尤為重要。

ADAMTS1是在對小鼠結(jié)腸腺癌基因進(jìn)行差異顯示的篩選中發(fā)現(xiàn)的[6]。ADAMTS1定位于人染色體21q21-q22,編碼含951個氨基酸的蛋白質(zhì),分子量約為100 kD。ADAMTS1可通過C-末端結(jié)合到血管內(nèi)皮生長因子VEGF165的肝素結(jié)合區(qū),從而阻斷了VEGF受體VEGFR2的磷酸化,進(jìn)而抑制內(nèi)皮增殖和血管生成。它還可以特異性地抑制上皮細(xì)胞增生,阻滯成纖維細(xì)胞生長因子-2(FGF-2)誘導(dǎo)的血管生成,具有抗血管生成作用[4],這在抑制腫瘤的血管形成中會發(fā)揮作用。正常情況下,ADAMTS1在許多組織中都高表達(dá),如心臟、肺、肝臟、骨骼肌和腎等中。

表1 ADAMTS1表達(dá)與口腔鱗狀細(xì)胞癌臨床病理特征的關(guān)系(例)

Table 1 Relationships between expression of ADAMTS1 and clinicopathological features of oral squamous cell carcinoma(cases)

變量nADAMTS1的表達(dá)(+)(-)χ2P性別0.0710.791 男341618 女1468年齡0.6710.413 <50歲16610 ≥50歲321616腫瘤部位2.9690.227 舌22814 頰1468 其他部位1284腫瘤直徑0.6710.413 ≥4 cm16610 <4 cm321616分化程度0.5690.753 高分化241212 中分化18810 低分化624淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移2.2080.137 (+)1028 (-)382018病理組織14.7550.0001 鱗癌組織482226 癌旁組織48408

有研究表明,ADAMTS1在胃癌中的表達(dá)水平低于其癌旁組織[7],食管鱗狀細(xì)胞癌組織中ADAMTS1 mRNA的表達(dá)顯著低于相應(yīng)的癌旁組織[8];采用RT-PCR對10株非小細(xì)胞肺癌和98例非小細(xì)胞肺癌標(biāo)本進(jìn)行ADAMTS1 mRNA的檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)30%的細(xì)胞系表達(dá)降低[9]。在乳腺癌[10-12]組織、前列腺癌[13]、結(jié)腸癌[14]、皮膚鱗狀細(xì)胞癌[15]組織中ADAMTS1的表達(dá)也均下調(diào)。

本實驗采用免疫組化對48例口腔鱗狀細(xì)胞癌及相應(yīng)的癌旁正常組織中ADAMTS1蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)ADAMTS1蛋白在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)顯著下調(diào),提示ADAMTS1可能是一種腫瘤生長抑制因子。

在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者中ADAMTS1的陽性表達(dá)率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者[7]。食管鱗狀細(xì)胞癌中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的ADAMTS1 mRNA表達(dá)水平顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組[8]。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌中,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的ADAMTS1陽性表達(dá)率低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者[16]。在本實驗中,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的口腔鱗狀細(xì)胞癌患者,ADAMTS1陽性表達(dá)率與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者相比較,兩者無統(tǒng)計學(xué)意義。ADAMTSl在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的不同腫瘤中表達(dá)不同,其差異可能與該基因在腫瘤中不同的作用機(jī)制以及腫瘤所處的腫瘤微環(huán)境有關(guān)。

Kilic等[17]研究表明ADAMTS1在胃癌的表達(dá)與腫瘤的分級、大小相關(guān)。而在本組實驗中ADAMTS1的表達(dá)與口腔鱗狀細(xì)胞癌患者的不同年齡、不同性別、不同發(fā)病部位、不同腫瘤大小及不同病理分化程度均無關(guān),差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。提示ADAMTS1對腫瘤作用的復(fù)雜性,在不同來源的腫瘤發(fā)生中有不同的作用,且存在組織特異性。

陳靜等[6]研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織中ADAMTS1基因啟動子甲基化可能是胃癌組織及細(xì)胞中ADAMTSl基因表達(dá)沉默的一個機(jī)制之一。在結(jié)腸直腸癌組織中也存在ADAMTS1基因CpG島的甲基化,而在正常或良性結(jié)腸直腸癌組織中卻未發(fā)現(xiàn)其DNA甲基化[18]。Tyan等[19]研究發(fā)現(xiàn)乳腺腫瘤可以誘導(dǎo)間質(zhì)成纖維細(xì)胞持續(xù)分泌ADAMTS1對機(jī)體進(jìn)行侵襲,這可能也是其機(jī)制的一部分。

ADAMTS1可以抑制血管形成,在腫瘤生長、浸潤、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。本實驗中ADAMTS1蛋白的陽性表達(dá)率顯著性低于癌旁組織,提示ADAMTS1是一個腫瘤生長抑制因子,可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān),但由于它的復(fù)雜性,機(jī)制也不是很清楚,關(guān)于ADAMTS1蛋白在口腔鱗狀細(xì)胞癌中對腫瘤進(jìn)展影響的確切機(jī)制還有待進(jìn)一步探索。